En komparativ metod för att karakterisera Landskap av värdpatogen Protein-protein interaktioner
Summary
Denna artikel fokuserar på identifiering av hög säker interaktion datamängder mellan värd och patogen proteiner med hjälp av en kombination av två ortogonala metoder: jäst två-hybrid följt av en hög genomströmning interaktion analys i däggdjursceller heter HT-GPCA.
Abstract
Betydande insatser har samlats för att skapa storskaliga omfattande protein-protein kartor interaktion nätverk. Detta är avgörande för att förstå patogen-värd relationer och var i huvudsak utförs av genetiska filmvisningar i jäst två-hybrid-system. Den senaste tidens förbättring av protein-protein växelverkan upptäckt av en Gaussia luciferas-baserad fragmentkomplettering analysen ger nu möjlighet att utveckla integrativa jämförande interactomic metoder som behövs för att noggrant jämföra Interaktionsprofilerna av proteiner från olika patogener stamvarianter mot en gemensam uppsättning av cellulära faktorer.
Denna uppsats fokuserar särskilt på nyttan av att kombinera två ortogonala metoder att generera protein-protein växelverkan dataset: jäst två-hybrid (Y2H) och en ny analys, hög genomströmning Gaussia princeps protein komplettering analys (HT-GPCA) utförs i däggdjursceller.
nt "är> En storskalig kartläggning av cellulära partners en patogen protein utförs av parning-baserade jäst två-hybrid screening av cDNA-bibliotek med flera varianter patogen stam. En delmängd av samverkande parter som valts på ett högt förtroende statistisk scoring är vidare validerats i däggdjursceller för parvisa interaktioner med hela uppsättningen av patogener varianter proteiner med HT-GPCA. Denna kombination av två kompletterande metoder förbättrar robustheten i samspelet dataset, och tillåter utförandet av en stringent komparativ interaktion analys. Sådana jämförande interactomics utgör en tillförlitlig och kraftfull strategi för att dechiffrera några patogen-värd samspelar.Introduction
Den ökande mängden data som samlas för att generera protein-protein växelverkan kartorna öppnar perspektiv för att ytterligare förstå patogena infektioner. Som global förståelse av patogener infektioner börjar dyka upp, det ger tillgång till olika störningar inducerade av patogener proteiner när du ansluter den mänskliga proteomet 1. Det finns därmed ett sätt att förstå hur patogener manipulera maskinen värdcellen. I synnerhet visade kartläggningen av flera virus-värd interaktioner nätverk som virala proteiner företrädesvis målvärden proteiner som är starkt kopplade i mobilnätet (hubbar), eller som är central för många vägar i ett nätverk (flaskhalsar proteiner) 2-4. Dessa interaktioner kan virus att manipulera viktiga cellulära processer, vilket är avgörande för att replikera och producera infektiös avkomma. Jämförande interaktioner kartläggning har nyligen genomförts på besläktade virus med målet att få fram information i förhållande tillpatogenes 4. Vidare har studier av värd-patogener interaktioner landskap utökats till många patogener 5. Målcellen faktorer identifiering ger insikter i de strategier som används av patogener att infektera celler och medger detektering av potentiellt patogena markörer.
Jästen två-hybrid systemet är den mest populära metoden för att identifiera binära interaktioner eftersom genetisk screening är ett effektivt och känsligt verktyg för high-throughput kartläggning av protein-protein interaktioner. Den metod som föreslås här ytterligare förbättrar enskilda Y2H filmvisningar genom att bedöma ett protein av flera patogener stamvarianter, vilket ger tillgång till en jämförande översikt av patogen-värd protein-protein interaktioner. Dessutom ligger en stor begränsning av jäst två-hybrid-screening i en hög falskt negativa takt, eftersom det återvinner cirka 20% av det totala interaktioner 6. Detta innebär att interaktioner detekterade med endast en delmängd av patogens varianter kan ha undgått upptäckt med de andra. Därför är enskilda partner dyker upp från alla två-hybrid filmvisningar ytterligare utmanas för interaktion med ett komplett sortiment av studerade stammar, som ger komparativa interaktion datamängder. Eftersom det visades att kombinera olika metoder kraftigt ökar robustheten av protein-protein växelverkan dataset 7, är denna validering utförs i däggdjursceller genom en nyutvecklad protein-fragmentkomplettering analysen heter HT-GPCA 8. Denna cell-baserade system möjliggör detektion av proteininteraktioner genom komplementering av Gaussia princeps split luciferas och har utformats för att vara förenliga med en hög genomströmning format. Tack vare dess luminiscens-baserad teknik och dess låga bakgrundsljud jämfört med andra fluorescens-baserad analys, visar HT-GPCA en påfallande hög känslighet.
Sammantaget utgör detta tillvägagångssätt en effektivverktyg för att generera en omfattande kartläggning av värdpatogen samspelar, vilket är det första steget mot en global förståelse av värdcellen kapning.
Protocol
Representative Results
Discussion
Oberoende, jäst-två hybrid och däggdjur interaktion analyser, såsom GST pull-down, Lumier eller MAPPIT, har visat sig vara effektiva verktyg för att upptäcka protein-protein interaktioner, men begränsas av den höga andelen falskt positiva och falskt negativa interaktioner förknippade med dessa tekniker 15. Dessutom bevisar växer att kombinera ortogonala metoder ökar tillförlitligheten av den erhållna interaktionen dataset 7. Den senaste utvecklingen av HT-GPCA teknik som beskrivs här …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes delvis av medel från Institut Pasteur och genom bidrag från Ligue nationale contre le Cancer (bidrag R05/75-129 och RS07/75-75), Association pour la Recherche sur le Cancer (bidrag ARC A09 / 1/5031 och 4867), och den Agence Nationale de la Recherche (ANR07 MIME 009 02 och ANR09 MIEN 026 01). MM var en mottagare av ett MENRT gemenskap.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Yeast strains | Clontech | ||
| Minimal SD base | US biological | D9500 | |
| Amino acids | Sigma | ||
| 3-amino-1,2,4-Triazole (3-AT) | Acros organics | 264571000 | |
| Zymolase | Seikagaku | 120491 | |
| DMEM | Gibco-Life Technologies | 31966 | |
| Fetal bovine serum | BioWest | S1810 | |
| Phosphate buffer Saline (PBS) | Gibco-Life Technologies | 14190 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco-Life Technologies | 15140 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco-Life Technologies | 25300 | |
| Renilla luciferase assay | Promega | E2820 | |
| White culture plate | Greiner Bio-One | 655083 | |
| 96-wellPCR plates | 4titude | 4t-i0730/C | |
| Incubator (30 °C) | Memmert | ||
| Incubator (37 °C) | Heraeus | ||
| Luminometer | Berthold | Centro XS-LB 960 |
References
- Davey, N. E., Trave, G., Gibson, T. J. How viruses hijack cell regulation. Trends in Biochemical Sciences. 36, 159-169 (2011).
- Calderwood, M. A. Epstein-Barr virus and virus human protein interaction maps. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 7606-7611 (2007).
- de Chassey, B., et al. Hepatitis C virus infection protein network. Mol. Syst. Biol. 4, 230 (2008).
- Simonis, N., et al. Host-pathogen interactome mapping for HTLV-1 and -2 retroviruses. Retrovirology. 9, 26 (2012).
- Dyer, M. D., Murali, T. M., Sobral, B. W. The landscape of human proteins interacting with viruses and other pathogens. PLoS Pathog. 4, e32 (2008).
- Rual, J. F., et al. Towards a proteome-scale map of the human protein-protein interaction network. Nature. 437, 1173-1178 (2005).
- Venkatesan, K., et al. An empirical framework for binary interactome mapping. Nat. Methods. 6, 83-90 (2009).
- Cassonnet, P., et al. Benchmarking a luciferase complementation assay for detecting protein complexes. Nat. Methods. 8, 990-992 (2011).
- Ito, T., et al. A comprehensive two-hybrid analysis to explore the yeast protein interactome. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 4569-4574 (2001).
- Saldanha, A. J. Java Treeview–extensible visualization of microarray data. Bioinformatics. 20, 3246-3248 (2004).
- Smoot, M. E., Ono, K., Ruscheinski, J., Wang, P. L., Ideker, T. Cytoscape 2.8: new features for data integration and network visualization. Bioinformatics. 27, 431-432 (2011).
- Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources. Nat. Protoc. 4, 44-57 (2009).
- Muller, M., et al. Large scale genotype comparison of human papillomavirus E2-host interaction networks provides new insights for e2 molecular functions. PLoS Pathog. 8, e1002761 (2012).
- Neveu, G., et al. Comparative analysis of virus-host interactomes with a mammalian high-throughput protein complementation assay based on Gaussia princeps luciferase. Methods. , (2012).
- Braun, P., et al. An experimentally derived confidence score for binary protein-protein interactions. Nat. Methods. 6, 91-97 (2009).
