En komparativ tilgang til at karakterisere Landskab værtspatogene protein-protein interaktioner
Summary
Denne artikel fokuserer på identifikation af høj tillid interaktion datasæt mellem vært og patogen proteiner ved hjælp af en kombination af to ortogonale metoder: gær to-hybrid efterfulgt af en high-throughput interaktion assay i pattedyrceller kaldet HT-GPCA.
Abstract
Betydelig indsats var samlet for at generere store omfattende protein-protein interaktion netværk maps. Dette er medvirkende til at forstå de patogen-værts relationer, og var hovedsagelig udført af genetiske screeninger i gær to-hybrid-systemer. Den seneste forbedring af protein-protein interaktioner detektering af en Gaussia luciferase-baserede fragment komplementationsassay assay tilbyder nu mulighed for at udvikle integrative komparative interactomic tilgange er nødvendige for strengt sammenligne interaktion profiler af proteiner fra forskellige patogene stamme varianter mod et fælles sæt af cellulære faktorer.
Dette papir fokuserer specifikt på nytten af at kombinere to ortogonale metoder til at generere protein-protein interaktion datasæt: gær to-hybrid (Y2H) og en ny analyse, high-throughput Gaussia princeps protein komplementering assay (HT-GPCA) udført i mammale celler.
nt "> En storstilet identifikation af cellulære partnere i et patogen protein udføres ved parring-baserede gær to-hybrid screeninger af cDNA biblioteker ved hjælp af flere patogene stamme-varianter. En delmængde af interagerende partnere udvalgt på en høj selvtillid statistisk scoring er yderligere valideret i pattedyrceller for parvise interaktioner med hele sættet af patogene varianter proteiner ved hjælp af HT-GPCA. Denne kombination af to komplementære metoder forbedrer robustheden af samspillet datasæt, og tillader udførelsen af en stringent komparativ interaktion analyse. Sådanne komparative interactomics udgør en pålidelig og stærk strategi at dechifrere enhver patogen-vært samspil.Introduction
Den stigende mængde af data indsamlet for at generere protein-protein interaktion maps åbner perspektiver for yderligere at forstå patogene infektioner. Som global forståelse af patogene infektioner begynder at dukke op, det giver adgang til den række af forstyrrelser fremkaldt af patogener proteiner, når du tilslutter den menneskelige proteom 1.. Dermed tilbyder en måde at forstå, hvordan patogener manipulere værtscellemaskineriet. Især viste kortlægningen af flere viral-vært interaktion netværk, virale proteiner fortrinsvis målrette værtsproteiner der er stærkt forbundet i mobilnetværket (hubs), eller som er centralt for mange stier i et netværk (flaskehalse proteiner) 2-4. Disse interaktioner tillader virus at manipulere vigtige cellulære processer, hvilket er medvirkende til at replikere og producere infektiøse afkom. Sammenlignende interaktioner kortlægning blev for nylig gennemført på beslægtede vira med det mål at udtrække oplysninger i forhold tilpatogenese 4.. Desuden har undersøgelser af det vært-patogener interaktioner landskabet blevet udvidet til mange patogener 5. Den målrettede celle faktorer identifikation giver indsigt i de strategier, der anvendes af patogener til at inficere celler og tillader påvisning af potentielle patogene markører.
Gær to-hybrid-system er den mest populære metode til at identificere binære interaktioner da genetisk screening er en effektiv og følsom værktøj for high-throughput kortlægning af protein-protein interaktioner. Den her foreslåede metode yderligere forbedrer de enkelte Y2H screeninger ved at vurdere et protein med flere patogener stamme varianter, hvilket giver adgang til en sammenlignende oversigt patogen-vært protein-protein interaktioner. Desuden er en væsentlig begrænsning af gær to-hybrid screening ligger i en høj falsk-negativ rate, da det genopretter omkring 20% af de samlede interaktioner 6. Dette indebærer, at interaktioner detekteres med kun en delmængde af patogens varianter kunne have undgået detektion med de andre. Derfor er enkelte partnere nye fra alle de to-hybrid screeninger yderligere udfordret til interaktion med det komplette sortiment af undersøgte stammer, give sammenlignende interaktion datasæt. Da det blev påvist, at kombinere forskellige metoder kraftigt øger robustheden af protein-protein interaktion datasæt 7, er denne valideringen udføres i pattedyrceller ved en nyudviklet protein-fragment komplementationsassay assay kaldet HT-GPCA 8.. Denne celle-baseret system muliggør påvisning af protein-interaktioner ved komplementering af Gaussia princeps split luciferase og er designet til at være forenelig med en high-throughput format. Takket være sin luminescens-baseret teknologi, og dens lave baggrundsstøj sammenlignet med andre fluorescens-baserede assay, HT-GPCA viser en påfaldende høj følsomhed.
Samlet denne tilgang er en effektiv mådeværktøj til at generere en omfattende kortlægning af værtspatogene samspil, der repræsenterer det første skridt mod en global forståelse af værtscellen kapring.
Protocol
Representative Results
Discussion
Uafhængigt, gær-to hybrid-og pattedyr interaktion assays, såsom GST pull-down, Lumier eller MAPPIT, har vist sig at være effektive redskaber til at opdage protein-protein interaktioner, men er begrænset af den høje falsk positive og falsk negative interaktioner forbundet med disse teknikker 15.. Desuden beviser vokser at kombinere ortogonale metoder øger pålideligheden af de opnåede interaktion datasæt 7.. Den seneste udvikling af HT-GPCA teknikken beskrevet her har ikke alene forbedret f…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet delvist af midler fra Institut Pasteur og ved tilskud fra Ligue Nationale contre le Cancer (tilskud R05/75-129 og RS07/75-75), Foreningen pour la Recherche sur le Cancer (tilskud ARC A09 / 1/5031 og 4867), og Agence Nationale de la Recherche (ANR07 MIME 009 02 og ANR09 Mien 026 01). MM var en modtager af en MENRT fællesskab.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Yeast strains | Clontech | ||
| Minimal SD base | US biological | D9500 | |
| Amino acids | Sigma | ||
| 3-amino-1,2,4-Triazole (3-AT) | Acros organics | 264571000 | |
| Zymolase | Seikagaku | 120491 | |
| DMEM | Gibco-Life Technologies | 31966 | |
| Fetal bovine serum | BioWest | S1810 | |
| Phosphate buffer Saline (PBS) | Gibco-Life Technologies | 14190 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco-Life Technologies | 15140 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco-Life Technologies | 25300 | |
| Renilla luciferase assay | Promega | E2820 | |
| White culture plate | Greiner Bio-One | 655083 | |
| 96-wellPCR plates | 4titude | 4t-i0730/C | |
| Incubator (30 °C) | Memmert | ||
| Incubator (37 °C) | Heraeus | ||
| Luminometer | Berthold | Centro XS-LB 960 |
References
- Davey, N. E., Trave, G., Gibson, T. J. How viruses hijack cell regulation. Trends in Biochemical Sciences. 36, 159-169 (2011).
- Calderwood, M. A. Epstein-Barr virus and virus human protein interaction maps. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 7606-7611 (2007).
- de Chassey, B., et al. Hepatitis C virus infection protein network. Mol. Syst. Biol. 4, 230 (2008).
- Simonis, N., et al. Host-pathogen interactome mapping for HTLV-1 and -2 retroviruses. Retrovirology. 9, 26 (2012).
- Dyer, M. D., Murali, T. M., Sobral, B. W. The landscape of human proteins interacting with viruses and other pathogens. PLoS Pathog. 4, e32 (2008).
- Rual, J. F., et al. Towards a proteome-scale map of the human protein-protein interaction network. Nature. 437, 1173-1178 (2005).
- Venkatesan, K., et al. An empirical framework for binary interactome mapping. Nat. Methods. 6, 83-90 (2009).
- Cassonnet, P., et al. Benchmarking a luciferase complementation assay for detecting protein complexes. Nat. Methods. 8, 990-992 (2011).
- Ito, T., et al. A comprehensive two-hybrid analysis to explore the yeast protein interactome. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 4569-4574 (2001).
- Saldanha, A. J. Java Treeview–extensible visualization of microarray data. Bioinformatics. 20, 3246-3248 (2004).
- Smoot, M. E., Ono, K., Ruscheinski, J., Wang, P. L., Ideker, T. Cytoscape 2.8: new features for data integration and network visualization. Bioinformatics. 27, 431-432 (2011).
- Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources. Nat. Protoc. 4, 44-57 (2009).
- Muller, M., et al. Large scale genotype comparison of human papillomavirus E2-host interaction networks provides new insights for e2 molecular functions. PLoS Pathog. 8, e1002761 (2012).
- Neveu, G., et al. Comparative analysis of virus-host interactomes with a mammalian high-throughput protein complementation assay based on Gaussia princeps luciferase. Methods. , (2012).
- Braun, P., et al. An experimentally derived confidence score for binary protein-protein interactions. Nat. Methods. 6, 91-97 (2009).
