Uma abordagem comparativa para caracterizar a paisagem de Patógeno-Hospedeiro interações proteína-proteína

Summary

Este artigo centra-se na identificação de conjuntos de dados de interação de alta confiança entre hospedeiro e as proteínas do patógeno usando uma combinação de dois métodos ortogonais: levedura de dois híbridos seguido de um ensaio de interação de alto rendimento em células de mamíferos chamada HT-GPCA.

Abstract

Esforços significativos foram reunidos para gerar mapas de rede de interação grande escala global proteína-proteína. Isso é fundamental para compreender as relações patógeno-hospedeiro e foi essencialmente realizado por exames genéticos em leveduras sistemas de dois híbridos. A recente melhoria da detecção de interação proteína-proteína por um ensaio de complementação fragmento baseado luciferase Gaussia agora oferece a oportunidade de desenvolver abordagens integradoras interactomic comparativas necessárias para comparar rigorosamente perfis de interação de proteínas de diferentes variantes de deformação do patógeno contra um conjunto comum de fatores celulares.

Este trabalho concentra-se especificamente sobre a utilidade de combinar dois métodos ortogonais para gerar conjuntos de dados de interação proteína-proteína: levedura de dois híbridos (Y2H) e um novo ensaio, Gaussia princeps ensaio complementação proteína de alto rendimento (HT-GPCA), realizado em células de mamíferos.

nt "> A identificação em larga escala de parceiros celulares de uma proteína patógeno é realizada por meio de cruzamentos de levedura baseado em rastreios de dois híbridos de bibliotecas de cDNA, utilizando múltiplas variantes de deformação do patógeno. Um subconjunto de parceiros que interagem seleccionados numa pontuação maior confiança estatística é maior validado em células de mamíferos para interações de pares com todo o conjunto de proteínas variantes do patógeno usando HT-GPCA. Esta combinação de dois métodos complementares melhora a robustez do conjunto de dados de interação, e permite a realização de uma análise comparativa interação rigoroso. Tais interactomics comparativos constituem uma estratégia confiável e poderoso para decifrar qualquer interplays patógeno-hospedeiro.

Introduction

O aumento da quantidade de dados coletados para gerar mapas de interação proteína-proteína abre perspectivas para entender melhor as infecções do patógeno. A compreensão global das infecções de agentes patogénicos começa a surgir, proporciona acesso à gama de perturbações induzidas por proteínas de agentes patogénicos ao ligar o proteoma humano ^1. É, assim, oferece uma maneira de compreender como patógenos manipular a maquinaria da célula hospedeira. Em particular, o mapeamento de várias redes de interacção hospedeiro-viral revelou que as proteínas virais como alvo proteínas do hospedeiro, preferencialmente, que são altamente ligados em rede celular (cubos), ou que são o centro de muitos caminhos na rede (proteínas estrangulamentos) ^2-4. Essas interações permitem que os vírus para manipular processos celulares importantes, o que é fundamental para reproduzir e produzir descendência infeccioso. Comparada interações mapeamento foram recentemente realizados sobre vírus relacionados com o objetivo de extrair informações relativas àpatogénese ^4. Além disso, estudos do host patógenos interações paisagem foram estendidos para muitos patógenos ^5. A identificação de fatores de célula alvo fornece insights sobre as estratégias utilizadas pelos patógenos para infectar as células e permite a detecção de marcadores potenciais patogênicos.

O sistema de dois híbridos de levedura é o método mais popular para identificar interacções binários desde rastreio genético é uma ferramenta eficiente e sensível para o mapeamento de alto rendimento de interacções proteína-proteína. A abordagem aqui proposta melhora ainda mais a exames Y2H individuais, avaliando uma proteína de patógenos múltiplas variantes de tensão, proporcionando assim o acesso a uma visão comparativa das interações proteína-proteína patógeno-hospedeiro. Além disso, a maior limitação do rastreio de levedura de dois híbridos reside numa elevada taxa de falsos negativos, uma vez que se recupera cerca de 20% do total das interacções ^6. Isto implica que as interacções detectados com apenas um subconjunto dos agentes patogénicosgens variantes podem ter escapado à detecção com os outros. Portanto, parceiros individuais emergentes de todos os exames de dois híbridos são mais desafiados para a interação com a gama completa de cepas estudadas, fornecendo conjuntos de dados de interação comparativos. Uma vez que foi demonstrado que a combinação de diferentes metodologias aumenta fortemente a robustez da interacção proteína-proteína conjuntos de dados ^7, esta validação é realizada em células de mamíferos por um ensaio de complementação da proteína-fragmento recentemente desenvolvido chamado HT-GPCA ^8. Este sistema baseado em células permite a detecção de interacções proteicas por complementação da Gaussia princeps dividir luciferase e foi concebido para ser compatível com um formato de alto rendimento. Graças à sua tecnologia baseada em luminescência e seu baixo ruído de fundo em comparação com outro ensaio baseado em fluorescência, HT-GPCA mostra uma impressionante alta sensibilidade.

No geral, esta abordagem constitui uma eficienteferramenta para gerar um mapeamento abrangente de interplays patógeno-hospedeiro, o que representa o primeiro passo em direção a uma compreensão global da célula hospedeira seqüestro.

Protocol

1. Levedura Screenings dois híbridos Faça as seguintes soluções necessárias: Completa Fora gota sintético (SD): Dissolver 26,7 g de base de DP mínimo com glucose em 1 L de água. Adicionam-se 2 g de uma mistura de aminoácidos preparada como se segue: 2 g de hemi-sulfato de adenina, 2 g de arginina HCl, 2 g de histidina HCl, 2 g de isoleucina, leucina 4 g, 2 g de Lisina, 2 g de Metionina, Fenilalanina 3 g, 2 g de L -serina, 2 g de L-Treonina, Triptofan…

Representative Results

Uma grande força de HT-GPCA reside na sua elevada sensibilidade, tal como ilustrado pela avaliação das taxas de falsos positivos e falsos negativos para a proteína E2 de HPV na Figura 2 (adaptado da referência 13). Para determinar a taxa de falsos negativos, interacções conhecidas de E2 de HPV16 foram avaliadas por HT-GPCA (Figura 2A). Quatro dos 18 interacções não foram recuperados (correspondente a uma taxa de falsos negativos de 22%). As interacções de falsos positivos fo…

Discussion

Independentemente, o fermento e dois ensaios de interação híbridos e mamíferos, como GST pull-down, lumier ou MAPPIT, provaram ser ferramentas eficazes para detectar interações proteína-proteína, mas são limitados pela alta taxa de falso-positivos e falso-negativos interacções associadas com estas técnicas ^15. Além disso, a evidência crescente de que a combinação de métodos ortogonais aumenta a confiabilidade do conjunto de dados de interação obtidas ^7. O desenvolvimento recente …

Materials

Name of Reagent/Material	Company	Catalog Number	Comments
Yeast strains	Clontech
Minimal SD base	US biological	D9500
Amino acids	Sigma
3-amino-1,2,4-Triazole (3-AT)	Acros organics	264571000
Zymolase	Seikagaku	120491
DMEM	Gibco-Life Technologies	31966
Fetal bovine serum	BioWest	S1810
Phosphate buffer Saline (PBS)	Gibco-Life Technologies	14190
Penicillin-Streptomycin	Gibco-Life Technologies	15140
Trypsin-EDTA	Gibco-Life Technologies	25300
Renilla luciferase assay	Promega	E2820
White culture plate	Greiner Bio-One	655083
96-wellPCR plates	4titude	4t-i0730/C
Incubator (30 °C)	Memmert
Incubator (37 °C)	Heraeus
Luminometer	Berthold	Centro XS-LB 960