Nous présentons ici un protocole optimisé et détaillé pour la double immunocoloration dans des coupes de tissu du système nerveux central (SNC) et des ganglions lymphatiques périphériques (LN) de rat fixées au formol et intégrées en paraffine.
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Article de méthode
Analyse immunohistochimique dans le système nerveux central et périphérique Rat ganglionnaire sections de tissu
Dans cet article
Résumé
Résumé
Immunohistochimie (IHC) permet une visualisation très spécifique, fiable et attrayante protéine. Des performances correctes et l'interprétation d'un étiquetage multicolore à base d'IHC est difficile, surtout lorsqu'il est utilisé pour évaluer les interrelations entre les protéines cibles dans le tissu avec une teneur élevée en matières grasses telles que le système nerveux central (SNC).
Notre protocole représente un perfectionnement de la technique d'immuno-marquage norme particulièrement ajustée pour la détection des deux protéines structurales et solubles dans le SNC de rat et de ganglions lymphatiques périphériques (LN) affecté par la neuro-inflammation. Néanmoins, avec ou sans autres modifications, notre protocole pourrait probablement être utilisé pour la détection d'autres cibles de protéines apparentées, même dans d'autres organes et des espèces que présenté ici.
Introduction
Malgré l'utilisation de pointe à haut débit les analyses effectuées sur le méthylome, transcriptome ou même au niveau du protéome, immunomarquage reste l'étalon or pour la détection de protéines directement dans l'échantillon de tissu, culture cellulaire ou un frottis cellulaire. En révélant le motif de localisation / distribution, immunohistochimie (IHC) peut évaluer les rapports relatifs et interrelations topographiques des protéines cibles, et même indiquer leurs activités biologiques. Par conséquent, IHC est largement utilisé à des fins cliniques et de recherche, par exemple, pour le diagnostic, les évaluations de traitement, l' étude des....
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Protocole
Déclaration éthique
Présente étude est réalisée conformément aux lignes directrices de l'Office national suédois pour les animaux de laboratoire et de la directive du Conseil Communauté européenne (86/609 / CEE) en vertu des permis éthiques N338 / 09, N15 / 10 et N65 / 10, qui ont été approuvés par le Comité du Nord de Stockholm animal éthique.
1. Préparation des tissus
- Perfusion et fixation
- Anesthetize l'animal avec de l'isoflurane pour effectuer la perfusion transcardial via ventricule gauche. Amorcer le rinçage du système vasculaire avec du tampon phosphate salin ....
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Résultats
immunomarquages doubles (co-Colorations) ont été réalisées dans fixés au formol, rat de paraffine sections CNS et LN. 3-5 um tranches de tissu d' épaisseur ont été découpées à l' aide d' un microtome de traîneau, monté ensuite sur des lames de verre adhésives pré-enduits et traités comme décrit précédemment 10,11,12. En bref, après déparaffinage, réhydratation des tissus et de la peroxydase endogène, l'inactivation, des sections ont été soumises au processus .......
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Discussion
les procédures IHC standard nécessitent souvent des ajustements spécifiques pour obtenir un résultat optimal, ce qui implique généralement une grande expérience, mais aussi l'approche "essais et erreurs". De la préparation des tissus jusqu'à la visualisation cible, presque chaque étape du protocole peut être soumis à des modifications conçues individuellement afin d'améliorer le résultat final. Double protocole de coloration présenté ici illustre la protéine à base de IHC ciblant particulièrement a.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.
Remerciements
Nous remercions Hans Lassmann et Jan Bauer pour leurs conseils et leur soutien. Nous remercions également Katalin Benedek pour l’excellente assistance technique et Caroline Westerlund pour l’évaluation critique et linguistique.
Cette étude a été financée par des subventions de Biogen Idec, de la Fondation Wenner-Gren, du Conseil suédois de la recherche, de l’Association suédoise des personnes atteintes de handicaps neurologiques, de la Fondation suédoise du cerveau, du 6e cadre de l’UE EURATools (LSHG-CT-2005-019015) et de Neuropromise (LSHM-CT-2005-018637). Les bailleurs de fonds n’ont joué aucun rôle dans la conception de l’étude, la coll....
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Réactif | |||
| Isoflurane (Isofluran) : 1-Chlor-2,2,2-trifluoréthyle (éther difluorméthylique) 2-Chlor-2-(difluorméthoxy)-1,1,1-trifluoréthan (C3H2ClF5O) | Baxter | 1001936060 | Irradiation oculaire. Influence probablement la fertilité et endommage le bébé dans l’utérus. Administrer uniquement dans un environnement anesthésiant correctement équipé. |
| Chlorure de sodium (NaCl) | Merck | 1.0604 | |
| Phosphate Tampon Saline (PBS), comprimé | Sigma-Aldrich | P4417 | |
| Paraformaldéhyde (OH(CH2O)nH (n = 8 - 100)), 4 % dans 1x PBS | Apl pharma | 34 24 28 | Danger pour la santé. Corrosif. Inflammable. Toxicité aiguë. |
| Éthanol ≥ ; 99,5 %, absolu (CH3CH2OH) | Sigma-Aldrich | 459844-1L | Inflammable. |
| Xylène (Xylènes, grade histologique ; C6H4(CH3)2 | Sigma-Aldrich | 534056 | Flamable. Toxicité aiguë. |
| Histo-Comp Paraffine Wax | Tissue-Tek | V0-5-1001 | |
| Lames de microscope adhésives | Starfrost | MIC-1040-W | |
| Substitut de xylol XEM-200 | Vogel GmbH | ND-HS-200 | Sensibilisation respiratoire. Cancérogénicité. |
| Souris &alpha ;-CD8 (Ox-8) anti-rat, anticorps primaire | AbD Serotec | MCA48G | |
| &alpha ;-Iba1 (AIF1) souris anti-rat, anticorps primaire | Millipore | MABN92 | |
| &alpha ;-CD68 (ED1) souris anti-rat, anticorps primaire | AbD Serotec | MCA341R | |
| &alpha ;-eotaxine C-19 (CCL11) chèvre anti-rat, anticorps primaire | Santa Cruz BT | SC-6181 | |
| Anticorps secondaire conjugué à la phosphatase alcaline (AP) | Dakopatts, Danemark | D0314 | |
| Anticorps secondaire biotinylé | Amersham Biotech | RPN1025 | |
| Complexe avidine-raifort-peroxydase (HRP) | Sigma-Aldrich | A3151 | |
| Naphtol AS-MX phosphate (C19H18NO5P) | Sigma-Aldrich | N4875-1G | Toxicité aiguë. |
| Sel Fast Blue RR, Azoïque Diazo n° 24 (C15H14ClN3O3 x 1/2 ZnCl2) | Sigma-Aldrich | FBS25 | |
| Chlorhydrate de lévamisol (C11H13ClN2S) | Sigma-Aldrich | 31742 | Toxicité aiguë. |
| Tétrachlorhydrate de 3,3'-diaminobenzidine (DAB Chromogen) | DAKO | S3000 | Hautement inflammable. Toxique. |
| Sulfate de cuivre (CuSO4) | Merck | 1.02791 | Toxicité aiguë. Danger environnemental. |
| GelTol Milieu de montage aqueux | Thermo Electron Corporation | 230100 | |
| Peroxyde d’hydrogène, 30 % (H2O2) | Merck | 107210 | Toxicité aiguë. |
| Méthanol (CH3OH) | Fluka | 65543 | Toxicité aiguë. Sensibilisation respiratoire. Cancérogénicité. Inflammable. |
| Tris (hydroxyméthyl) aminométhane, base TRIS (C4H11NO3 ) | AppliChem | A1379 | Irritation de la peau et des yeux. |
| Tris Saline tamponnée (TBS), comprimé | Sigma-Aldrich | T5030 | |
| Di- Hydrogénophosphate de sodium dihydraté (Na2HPO4 x 2H2O) | Merck | 1.0658 | |
| Dihydrogénophosphate de sodium monohydraté (NaH2PO4 x 1H2O) | Merck | 1.06346 | |
| Sérum de veau fœtal (FCS) | Cambrex BioScience | DE-14-802F | |
| DAKO tampon de lavage de cytomation 10x | DAKO | S3006 | Doit être conservé à 2-8 ° ; C pour inhiber la croissance bactérienne. Évitez la formation de mousse. |
| N,N-diméthylformamide ; DMF (C3H7NO) | Fluka | 40250 | Inflammable. Toxicité aiguë. |
| lamelles en verre 24 x 36 mm | Menzel-Glä ; ser | BB024036A1 | |
| Acide chlorhydrique, conc. (HCl) | Sigma-Aldrich | 30721 | Corrosif, irritant, perméateur. Sensibilisant pulmonaire (sous forme de brouillard acide). Toxique. |
| Solution d’acide chlorhydrique volumétrique, 2 M HCl (2 N) | Fluka | 71826 | Corrosif, irritant, perméateur. Sensibilisant pulmonaire (sous forme de brouillard acide). Toxique. |
| Nitrite de sodium, ReagentPlus, ≥ ; 99,0 % (NaNO2) | Sigma-Aldrich | S2252 | oxydant. Toxique. Dangereux pour l’environnement. |
| Sel disodique de l’acide éthylènedinitrilotétraacétique dihydraté (EDTA ; C10H14N2Na2O8 x 2H2O) | Merck | 1.08454 | L’exposition par voie orale peut avoir des effets sur la reproduction et le développement. |
| Equipment | |||
| >Tissue-TekV.I.P Processeur d’infiltration | sous vide Sakura | 5902 VIP Jr. 115 V, 60 Hz | |
| Hacker-Bright 8000 Series Base Sledge Microtome | Hacker instruments | ||
| Cuiseur vapeur pour aliments ménagers | Braun | MultiGourmet FS 20 | |
| Microscope optique | Leica Polyvar 2 |
Références
- Coons, A., Creech, H. J., Jones, R. N. Immunological properties of an antibody containing a fluorescent group. Proc Soc Exp Biol Med. 47, 200-202 (1941).
- Nakane, P. K., Pierce, G. B.
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Réimpressions et autorisations
