تحليل المناعى في الجهاز العصبي المركزي والمحيطي الجرذ العقدة الليمفاوية أقسام الأنسجة
Summary
We here present an optimized, detailed protocol for double immunostaining in formalin-fixed, paraffin-embedded rat central nervous system (CNS) and peripheral lymph node (LN) tissue sections.
Abstract
المناعية (IHC) يوفر محددة للغاية، موثوقة وجذابة التصور البروتين. الأداء الصحيح والتفسير لوضع العلامات متعدد الألوان استنادا IHC-هو أمر صعب، خصوصا عندما تستخدم لتقييم العلاقات المتبادلة بين البروتينات المستهدفة في الأنسجة ذات المحتوى العالي من الدهون مثل الجهاز العصبي المركزي (CNS).
ويمثل بروتوكول لدينا صقل تقنية immunolabeling القياسية المعدلة وخاصة للكشف عن كل من البروتينات الهيكلية والقابلة للذوبان في الفئران الجهاز العصبي المركزي والغدد الليمفاوية الطرفية (LN) تتأثر neuroinflammation. ومع ذلك، مع أو من دون مزيد من التعديلات، يمكن أن المرجح أن تستخدم بروتوكول لدينا للكشف عن أهداف البروتين الأخرى ذات الصلة، حتى في الأجهزة والأنواع الأخرى من المقدمة هنا.
Introduction
وعلى الرغم من استخدام متقدمة عالية الإنتاجية التحليلات التي أجريت على methylome، Transcriptome على أو حتى مستوى بروتيوم، لا يزال المناعية المعيار الذهبي للكشف عن البروتين مباشرة في عينات الأنسجة، زراعة الخلايا أو مسحة الخلية. من خلال الكشف عن نمط التعريب / التوزيع، المناعية (IHC) قد تقييم نسب النسبية والعلاقات المتبادلة الطبوغرافية من البروتينات المستهدفة، وحتى تشير الأنشطة البيولوجية. لذلك، ويستخدم على نطاق واسع لأغراض IHC السريرية والبحوث، على سبيل المثال، للتشخيص والتقييم العلاج، ودراسة آليات المرض، وإجراء التعديلات الفنية وphenotypical في النماذج الحيوانية، الخ
تتألف أساسا الأنسجة، علم الأمراض، والكيمياء الحيوية وعلم المناعة، وقد تقدمت IHC بشكل ملحوظ منذ عام 1941، عندما كانت تستخدم الأجسام المضادة fluorescently المسمى لأول مرة لتحديد المستضدات المكورات الرئوية في الأنسجة المصابة 1. الخامسويستند isualization من المنتجات الخلوية والمكونات التي كتبها IHC على ربط الأجسام المضادة (عبس) لمستضد معين من (حج). بالإضافة إلى استخدام fluorophore الموسومة الأجسام المضادة، ويمكن أيضا التفاعلات المناعية يمكن تصور باستخدام الإنزيمات مثل البيروكسيديز 2،3 أو الفوسفاتيز القلوية 4. وعلاوة على ذلك، يتم استخدام الغروية الأجسام المضادة الموسومة الذهب 5 للكشف عن تفاعل ضد مستضد معين من قبل كل من الضوء والمجهر الإلكتروني، في حين تصور تسميات المشعة عن طريق تصوير الإشعاع الذاتي.
وتفاعل مناعي حج-أب يمكن أن يتم الكشف عن طريق وسائل مباشرة وغير مباشرة. الطريقة المباشرة هي في جوهرها أسرع وأبسط، كما أنه يستخدم المسمى مباشرة عبس الأساسي 6. ولكن نظرا لنقص كبير في الحساسية، ويفضل الطرق غير المباشرة لتلك المباشرة. خطوتين إجراءات الكشف غير المباشرة تتطلب الخالي من الملصقات عبس الأساسي، كما الأولى، وصفت عبس الثانوية موجهة ضد عبس الابتدائي، والطبقة الثانية 7.تضخيم إشارة يمكن أن يتحقق من خلال إشراك أبعد من ذلك، يقترن انزيم العالي أب (ثلاث خطوات الطريقة غير المباشرة) التي تربط لأب الثانوي. يشيع استخدامها طرق الكشف غير المباشرة أفيدين البيوتين والبيروكسيديز-antiperoxidase (PAP). بدلا من ذلك، الفوسفاتيز القلوية-antialkaline الفوسفاتيز (APAAP) مجمع يمكن أن تستخدم بدلا من أسلوب PAP. والجدير بالذكر أن تظهر الفوسفاتيز القلوية (ا ف ب) طرق لتكون أكثر حساسية من طرق المناعي 4. يستخدم معقدة (ABC) طريقة أفيدين البيوتين أب الثانوي المعقدة البيروكسيديز في تركيبة مع أي المسمى أفيدين البيوتين معقد (LAB)، أو المسمى streptavidin البيوتين معقد (سلاب). حساسية الكشف يمكن زيادة أخرى عن طريق إشراك أفيدين المسمى مع البيروكسيديز أو الفوسفاتيز القلوية 8. طرق الكشف أخرى في الاستخدام هي العلامات البوليمر، والتضخيم، الثيامين والمناعية المتداول دائرة 9. والجدير بالذكر أن طرق الكشف مختلفة يمكن الجمع للكشف عن حج متعددة في نفس النسيجتم إجراء العينة التي تم الإبلاغ عنها للمرة الأولى في عام 1978 (4). المناعية مزدوجة في وقت واحد المقدمة هنا في الثابتة الفورمالين، جزءا لا يتجزأ من البارافين الفئران الجهاز العصبي المركزي وLN أقسام الأنسجة باستخدام الأجسام المضادة الثانوية محددة البيروكسيديز وAP-مترافق، على التوالي. وتصور الإشارات باستخدام 3،3'-diaminobencidine (DAB) مولد اللون والأزرق السريع (FB) APAAP المجمع، على التوالي.
Protocol
Representative Results
Discussion
وغالبا ما تتطلب إجراءات IHC القياسية تعديلات محددة للحصول على نتيجة أفضل، وهو ما يعني عادة خبرة واسعة ولكن أيضا "التجربة والخطأ" النهج. من إعداد الأنسجة حتى التصور الهدف، لا يجوز إخضاع تقريبا كل خطوة في بروتوكول لمصممة بشكل فردي التعديلات من أجل تحسين النتيجة …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Hans Lassmann and Jan Bauer for their guidance and support. We also thank Katalin Benedek for excellent technical assistance and Caroline Westerlund for critical and linguistic appraisal.
This study was supported by grants from Biogen Idec, the Wenner-Gren Foundation, the Swedish Research Council, the Swedish Association of Persons with Neurological Disabilities, Swedish Brain Foundation, the EU 6TH Framework EURATools (LSHG-CT-2005-019015) and Neuropromise (LSHM-CT-2005-018637). The funders had no role in study design, data collection and analysis, decision to publish, or preparation of the manuscript.
Materials
| Reagent | |||
| Isoflurane (Isofluran): 1-Chlor-2,2,2-trifluorethyl (difluormethyl ether) 2-Chlor-2-(difluormethoxy)-1,1,1-trifluorethan (C3H2ClF5O) | Baxter | 1001936060 | Eye irradiation. Probably influences fertility and damages baby in uterus. Administer only in adequately equipped anesthetizing environment. |
| Sodiumchloride (NaCl) | Merck | 1.0604 | |
| Phosphate Buffer Saline (PBS), tablet | Sigma-Aldrich | P4417 | |
| Paraformaldehyde (OH(CH2O)nH (n = 8 – 100), 4% in 1x PBS | Apl pharma | 34 24 28 | Health hazard. Corrosive. Flamable. Acute toxicity. |
| Ethanol ≥99.5%, absolute (CH3CH2OH) | Sigma-Aldrich | 459844-1L | Flamable. |
| Xylene (Xylenes, histological grade; C6H4(CH3)2 | Sigma-Aldrich | 534056 | Flamable. Acute toxicity. |
| Histo-Comp Paraffin Wax | Tissue-Tek | V0-5-1001 | |
| Adhesive Microscope Slides | Starfrost | MIC-1040-W | |
| Xylol substitute XEM-200 | Vogel GmbH | ND-HS-200 | Respiratory sensitization. Carcinogenicity. |
| α- CD8 (Ox-8) mouse anti-rat, primary antibody | AbD Serotec | MCA48G | |
| α- Iba1 (AIF1) mouse anti-rat, primary antibody | Millipore | MABN92 | |
| α- CD68 (ED1) mouse anti-rat, primary antibody | AbD Serotec | MCA341R | |
| α- eotaxin C-19 (CCL11) goat anti-rat, primary antibody | Santa Cruz BT | SC-6181 | |
| Alkaline phosphatase (AP)-conjugated secondary antibody | Dakopatts, Denmark | D0314 | |
| Biotinylated secondary antibody | Amersham Biotech | RPN1025 | |
| Avidin- horseradish peroxidase complex (HRP) | Sigma-Aldrich | A3151 | |
| Naphthol AS-MX phosphate (C19H18NO5P) | Sigma-Aldrich | N4875-1G | Acute toxicity. |
| Fast Blue RR Salt, Azoic Diazo No. 24 (C15H14ClN3O3 x 1/2 ZnCl2) | Sigma-Aldrich | FBS25 | |
| Levamisol hydrochloride (C11H13ClN2S) | Sigma-Aldrich | 31742 | Acute toxicity. |
| 3,3′-Diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB Chromogen) | DAKO | S3000 | Highly flammable. Toxic. |
| Copper sulphate (CuSO4) | Merck | 1.02791 | Acute toxicity. Environmental hazzard. |
| GelTol Aqueous Mounting Medium | Thermo Electron Corporation | 230100 | |
| Hydrogen peroxide, 30% (H2O2) | Merck | 107210 | Acute toxicity. |
| Methanol (CH3OH) | Fluka | 65543 | Acute toxicity. Respiratory sensitization. Carcinogenicity. Flammable. |
| Tris (hydroxymethyl) aminomethane, TRIS base (C4H11NO3 ) | AppliChem | A1379 | Skin and eye irritation. |
| Tris Buffered Saline (TBS), tablet | Sigma-Aldrich | T5030 | |
| Di- Sodium hydrogen phosphate dihydrate (Na2HPO4 x 2H2O) | Merck | 1.0658 | |
| Sodium dihydrogen phosphate monohydrate (NaH2PO4 x 1H2O) | Merck | 1.06346 | |
| Fetal calf serum (FCS) | Cambrex BioScience | DE-14-802F | |
| DAKO cytomation wash buffer 10x | DAKO | S3006 | Should be stored at 2-8 °C to inhibit bacterial growth. Avoid foaming. |
| N,N- Dimethylformamide; DMF (C3H7NO) | Fluka | 40250 | Flammable. Acute toxicity. |
| Glas coverslips 24 x 36 mm | Menzel-Gläser | BB024036A1 | |
| Hydrochloric acid, conc. (HCl) | Sigma-Aldrich | 30721 | Corrosive, irritant, permeator. Lung sensitizer (as acid mist). Toxic. |
| Hydrochloric acid solution volumetric, 2M HCl (2N) | Fluka | 71826 | Corrosive, irritant, permeator. Lung sensitizer (as acid mist). Toxic. |
| Sodium nitrite, ReagentPlus, ≥99.0% (NaNO2) | Sigma-Aldrich | S2252 | Oxidant. Toxic. Dangerous for the environment. |
| Ethylenedinitrilotetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA; C10H14N2Na2O8 x 2H2O) | Merck | 1.08454 | Oral exposures may cause reproductive and developmental effects. |
| Equipment | |||
| Tissue-Tek V.I.P Vacuum Infiltration Processor | Sakura | 5902 VIP Jr. 115 V, 60 Hz | |
| Hacker-Bright 8000 Series Base Sledge Microtome | Hacker instruments | ||
| Household food steamer | Braun | MultiGourmet FS 20 | |
| Light microscope | Leica Polyvar 2 |
References
- Coons, A., Creech, H. J., Jones, R. N. Immunological properties of an antibody containing a fluorescent group. Proc Soc Exp Biol Med. 47, 200-202 (1941).
- Nakane, P. K., Pierce, G. B. Enzyme-labeled antibodies: preparation and application for the localization of antigens. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 14, 929-931 (1966).
- Avrameas, S., Uriel, J. Method of antigen and antibody labelling with enzymes and its immunodiffusion application. C R Acad Sci Hebd Seances Acad Sci D. 262, 2543-2545 (1966).
- Mason, D. Y., Sammons, R. Rapid preparation of peroxidase: anti-peroxidase complexes for immunocytochemical use. Journal of immunological. 20, 317-324 (1978).
- Faulk, W. P., Taylor, G. M. An immunocolloid method for the electron microscope. Immunochemistry. 8, 1081-1083 (1971).
- Coons, A. H., Kaplan, M. H. Localization of antigen in tissue cells; improvements in a method for the detection of antigen by means of fluorescent antibody. The Journal of experimental medicine. 91, 1-13 (1950).
- Polak, J. M., Van Noorden, S. . Introduction to immunocytochemistry. , (2003).
- Elias, J. M., Margiotta, M., Gaborc, D. Sensitivity and detection efficiency of the peroxidase antiperoxidase (PAP), avidin-biotin peroxidase complex (ABC), and peroxidase-labeled avidin-biotin (LAB) methods. American journal of clinical pathology. 92, 62-67 (1989).
- Ramos-Vara, J. A. Technical aspects of immunohistochemistry. Vet Pathol. 42, 405-426 (2005).
- Adzemovic, M. Z., et al. Expression of Ccl11 associates with immune response modulation and protection against neuroinflammation in rats. PloS one. 7, 39794 (2012).
- Bauer, J., et al. Endoplasmic reticulum stress in PLP-overexpressing transgenic rats: gray matter oligodendrocytes are more vulnerable than white matter oligodendrocytes. Journal of neuropathology and experimental neurology. 61, 12-22 (2002).
- Bradl, M., Bauer, J., Flugel, A., Wekerle, H., Lassmann, H. Complementary contribution of CD4 and CD8 T lymphocytes to T-cell infiltration of the intact and the degenerative spinal cord. The American journal of pathology. 166, 1441-1450 (2005).
- Zhang, C., Lam, T. T., Tso, M. O. Heterogeneous populations of microglia/macrophages in the retina and their activation after retinal ischemia and reperfusion injury. Experimental eye research. 81, 700-709 (2005).
- Hirasawa, T., et al. Visualization of microglia in living tissues using Iba1-EGFP transgenic mice. Journal of neuroscience research. 81, 357-362 (2005).
- Norment, A. M., Salter, R. D., Parham, P., Engelhard, V. H., Littman, D. R. Cell-cell adhesion mediated by CD8 and MHC class I molecules. Nature. 336, 79-81 (1988).
- Hoetelmans, R. W., van Slooten, H. J., Keijzer, R., Jvan de Velde, C. J., van Dierendonck, J. H. Routine formaldehyde fixation irreversibly reduces immunoreactivity of Bcl-2 in the nuclear compartment of breast cancer cells, but not in the cytoplasm. Applied immunohistochemistry & molecular morphology : AIMM / official publication of the Society for Applied Immunohistochemistry. 9, 74-80 (2001).
- Hayat, M. . Microscopy, Immunohistochemistry and antigen retrieval methods for light and electron microscopy. , (2002).
- Boenisch, T. Formalin-fixed and heat-retrieved tissue antigens: a comparison of their immunoreactivity in experimental antibody diluents. Applied immunohistochemistry & molecular morphology : AIMM / official publication of the Society for Applied Immunohistochemistry. 9, 176-179 (2001).
- Shi, S. R., Key, M. E., Kalra, K. L. Antigen retrieval in formalin-fixed, paraffin-embedded tissues: an enhancement method for immunohistochemical staining based on microwave oven heating of tissue sections. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 39, 741-748 (1991).
- Huang, S. N. Immunohistochemical demonstration of hepatitis B core and surface antigens in paraffin sections. Laboratory investigation; a journal of technical methods and pathology. 33, 88-95 (1975).
- Shi, S. R., Cote, R. J., Taylor, C. R. Antigen retrieval immunohistochemistry: past, present, and future. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 45, 327-343 (1997).
- Taylor, C. R., Shi, S. R. Antigen retrieval: call for a return to first principles. Applied immunohistochemistry & molecular morphology : AIMM / official publication of the Society for Applied Immunohistochemistry. 8, 173-174 (2000).
- Kitamoto, T., Ogomori, K., Tateishi, J., Prusiner, S. B. Formic acid pretreatment enhances immunostaining of cerebral and systemic amyloids. Laboratory investigation; a journal of technical methods and pathology. 57, 230-236 (1987).
- Nelson, P. N., et al. Monoclonal antibodies. Molecular pathology : MP. 53, 111-117 (2000).
- Van der Loos, C. . Immunoenzyme multiple staining methods. , (1999).
- Elias, J. . Immunohistopathology. A practical approach to diagnosis. , (2003).
- Straus, W. Letter: Cleavage of heme from horseradish peroxidase by methanol with inhibition of enzymic activity. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 22, 908-911 (1974).
- Streefkerk, J. G. Inhibition of erythrocyte pseudoperoxidase activity by treatment with hydrogen peroxide following methanol. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 20, 829-831 (1972).
- Ponder, B. A., Wilkinson, M. M. Inhibition of endogenous tissue alkaline phosphatase with the use of alkaline phosphatase conjugates in immunohistochemistry. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 29, 981-984 (1981).
- Petrelli, F., Coderoni, S., Moretti, P., Paparelli, M. Effect of biotin on phosphorylation, acetylation, methylation of rat liver histones. Molecular biology reports. 4, 87-92 (1978).
- Yagi, T., Terada, N., Baba, T., Ohno, S. Localization of endogenous biotin-containing proteins in mouse Bergmann glial cells. The Histochemical journal. 34, 567-572 (2002).
- Van Hecke, D. Routine Immunohistochemical Staining Today: Choices to Make, Challenges to Take. Journal of Histotechnology. 1, 45-54 (2002).
