Nous présentons ici un protocole optimisé et détaillé pour la double immunocoloration dans des coupes de tissu du système nerveux central (SNC) et des ganglions lymphatiques périphériques (LN) de rat fixées au formol et intégrées en paraffine.
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Article de méthode
Analyse immunohistochimique dans le système nerveux central et périphérique Rat ganglionnaire sections de tissu
Dans cet article
Résumé
Résumé
Immunohistochimie (IHC) permet une visualisation très spécifique, fiable et attrayante protéine. Des performances correctes et l'interprétation d'un étiquetage multicolore à base d'IHC est difficile, surtout lorsqu'il est utilisé pour évaluer les interrelations entre les protéines cibles dans le tissu avec une teneur élevée en matières grasses telles que le système nerveux central (SNC).
Notre protocole représente un perfectionnement de la technique d'immuno-marquage norme particulièrement ajustée pour la détection des deux protéines structurales et solubles dans le SNC de rat et de ganglions lymphatiques périphériques (LN) affecté par la neuro-inflammation. Néanmoins, avec ou sans autres modifications, notre protocole pourrait probablement être utilisé pour la détection d'autres cibles de protéines apparentées, même dans d'autres organes et des espèces que présenté ici.
Introduction
Malgré l'utilisation de pointe à haut débit les analyses effectuées sur le méthylome, transcriptome ou même au niveau du protéome, immunomarquage reste l'étalon or pour la détection de protéines directement dans l'échantillon de tissu, culture cellulaire ou un frottis cellulaire. En révélant le motif de localisation / distribution, immunohistochimie (IHC) peut évaluer les rapports relatifs et interrelations topographiques des protéines cibles, et même indiquer leurs activités biologiques. Par conséquent, IHC est largement utilisé à des fins cliniques et de recherche, par exemple, pour le diagnostic, les évaluations de traitement, l' étude des mécanismes de la maladie, des altérations fonctionnelles et phénotypiques dans des modèles animaux, etc.
Comprenant essentiellement l' histologie, la pathologie, la biochimie et l' immunologie, IHC a considérablement progressé depuis 1941, lorsque les anticorps marqués par fluorescence ont été utilisés pour la première fois pour identifier des antigènes pneumococciques dans le tissu infecté 1. Visualization des produits et des composants par IHC cellulaires est basée sur la liaison des anticorps (Abs) à leur antigène spécifique (Ag). En plus d' utiliser des anticorps fluorophores marqués, les réactions immunitaires peuvent également être visualisés à l'aide d' enzymes comme la peroxydase ou la phosphatase alcaline 2,3 4. En outre, des anticorps marqués de l' or colloïdal 5 sont utilisés pour détecter l' interaction antigène-anticorps spécifique à la fois par la lumière et par microscopie électronique, tandis que des marqueurs radioactifs sont visualisées par autoradiographie.
Le immunoréaction Ag-Ab peut être détectée par des méthodes directes et indirectes. La méthode directe est essentiellement plus rapide et plus simple, car il utilise directement marqué Abs primaire 6. Cependant, en raison du manque de sensibilité significative, les méthodes indirectes sont préférées aux directs. Procédures de détection indirecte en deux étapes nécessitent Abs primaire non marqués, comme le premier, et étiquetés Abs secondaires dirigés contre le Abs primaire, la seconde couche 7.l'amplification du signal peut être obtenue en associant en outre, une enzyme couplée tertiaire Ab (trois étapes méthode indirecte) qui se fixe à l'Ac secondaire. des procédés de détection indirecte couramment utilisés sont la biotine et l'avidine-peroxydase de antiperoxydase (PAP). En variante, la phosphatase alcaline phosphatase antialkaline complexe (APAAP) peut être utilisé à la place de la méthode PAP. Notamment, la phosphatase alcaline (AP) méthodes semblent être encore plus sensible que les méthodes d'immunoperoxydase 4. méthode de complexe avidine-biotine (ABC) utilise biotinylé Ab secondaire en combinaison avec soit étiqueté complexe avidine-biotine (LAB), ou étiqueté streptavidine-biotine complexe (SLAB). La sensibilité de détection peut être encore augmentée en y associant l' avidine marquée à la peroxydase ou la phosphatase alcaline 8. D' autres méthodes de détection utilisées sont l' étiquetage polymère, tyramine amplification et immuno-cercle roulant 9. En particulier, les différentes méthodes de détection peuvent être combinés pour la détection multiple Ag dans le même tissuéchantillon, qui a été signalé pour la première fois en 1978 4. à double immunocoloration simultanée présentée ici a été réalisée dans des coupes de tissus fixés au formol, rat de paraffine et du SNC LN en utilisant des anticorps secondaires peroxydase lié et AP-conjugués, respectivement. Les signaux ont été visualisées en utilisant 3,3'-diaminobencidine (DAB) chromogène et le Fast Blue (FB) APAAP complexe, respectivement.
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Protocole
Déclaration éthique
Présente étude est réalisée conformément aux lignes directrices de l'Office national suédois pour les animaux de laboratoire et de la directive du Conseil Communauté européenne (86/609 / CEE) en vertu des permis éthiques N338 / 09, N15 / 10 et N65 / 10, qui ont été approuvés par le Comité du Nord de Stockholm animal éthique.
1. Préparation des tissus
- Perfusion et fixation
- Anesthetize l'animal avec de l'isoflurane pour effectuer la perfusion transcardial via ventricule gauche. Amorcer le rinçage du système vasculaire avec du tampon phosphate salin (PBS) pour éliminer les composants du sang, suivie par 4% de paraformaldehyde dans du PBS 0,1 M (PFA).
- Fixer les cerveaux disséqués, la moelle épinière et des tissus LN périphérique par immersion en PFA. Après 24 heures à 4 ° C, transférer le tissu de PFA dans du PBS et conserver à 4 ° C jusqu'à un traitement ultérieur. Alternativement à PBS commercial, dissoudre 9 g de NaCl dans 250 ml du S &# 246; tampon rensen et ajouter 750 ml d' eau déminéralisée (dH 2 O); pour préparer 0,2 M de tampon Sörensen (pH 7,4) , dissoudre 13,8 g de NaH 2 PO 4 x 1 H 2 O et 71,2 g de Na 2 HPO 4 x 2 H 2 O dans 2,5 L dH 2 O.
- Déshydratation et intégration
- Couper le tissu dans des parties épaisses d'environ 5 mm en utilisant une lame de rasoir.
- Initier le processus de durcissement du tissu (déshydratation) en utilisant le vide VIP Infiltration Processeur Tissue-Tek (procédure standard basée sur l' immersion dans des concentrations croissantes d'éthanol, suivi par du xylène et enfin la paraffine (tableau 1).
- Placez le tissu dans un moule et versez dans la paraffine liquide autour de l'échantillon pour former un «bloc de paraffine". Le stockage à long terme nécessite la température ambiante (RT). Cependant, avant la coupe, il est recommandé de refroidir les blocs, par exemple pendant une nuit (o / n) à 4 ° C.
2. Sectionnement
- Placer le bloc de paraffine dans un support fixe du microtome traîneau, qui peut se déplacer d'avant en arrière à travers le couteau. Ajuster l'angle optimal entre le bloc et la lame de microtome (qui dépend de la géométrie du couteau, mais aussi de la vitesse de coupe et de la technique).
- Couper 3-5 um d'épaisseur des sections transversales du bloc de paraffine.
- Transfert section simplement couper dans un récipient d'eau et monter ensuite de l'eau sur la lame de verre.
- Appuyez sur la section montée avec précaution contre une serviette en papier pour éliminer l'eau résiduelle et les bulles d'air éventuelles. des lames de verre adhésives commercialement pré-revêtus sont à recommander.
- Dry diapositives montées pour un couple d'heures dans une étuve à 50 - 60 ° C.
3. Déparaffinage (Réhydratation et blocage de l'Endogène peroxydase)
- Immergez les diapositives 2x dans le xylène (substitut alternativement xylèneXEM-200), chaque fois 15 - 20 '.
- Rincer à l'éthanol à 99%.
- Pour bloquer l'activité de peroxydase endogène, incuber les sections pendant 30 minutes dans une solution de methanol contenant 0,25% de peroxyde d'hydrogène.
- Continuer la réhydratation en utilisant de l'éthanol avec l'augmentation de la teneur en eau (99%, 70%, de se retrouver dans l'eau distillée.
- De ce point jusqu'à ce que le montage du couvercle glisse sections doivent être maintenus humides.
4. Antigène Retrieval
- Utilisez un cuiseur pour faire bouillir les lames dans une solution de récupération d'antigène (dans ce cas EDTA pH 8,5 tampon) 60 '(stock tampon solution d'EDTA contient 1,21 g de Tris et 0,37 g d' EDTA dans 50 ml dH 2 O; pour préparer le travail 2.5ml EDTA solution mère solution diluée dans 47,5 ml 2 O dH).
- Refroidir les lames sur la température ambiante pendant env. 1 h, puis rincer 3 - 5x avec une solution saline tamponnée Tris (TBS, utiliser alternativement PBS) constitué de Tris 0,05 M et 0,15 M de NaCl; pH 7,5 ajusté wie HCl. Vous pouvez également utiliser le SCT commercial.
5. Le blocage des sites de liaison Unspecific
- Pour éviter des réactions de fond non spécifiques, incuber les sections sur RT pour 30 'dans la solution de blocage contenant 10% de sérum de veau foetal (FCS) et le tampon DAKO 90%.
6. Double immunomarquage: Incubation simultanée avec les Abs primaires
- Diluer quantité requise d'anticorps primaires dans la solution de blocage et incuber o / n à 4 ° C. Pour la double immunocoloration combiner α-éotaxine (CCL11, 1: 300) avec α-CD68 (Ed1; 1: 1000) ou α-Iba1 (AIF1, 1: 1000) ou α-CD8a (Ox-8; 1: 200) .
- Rincer les lames 3-5x avec un tampon TBS (utiliser un tampon DAKO alternativement 10x dilué).
- Diluer quantité requise d'anticorps secondaire (anti-chèvre biotinylé anti-souris et de l'AP-conjugué, à la fois 1: 200) dans de la solution de blocage et incuber pendant 1 heure à température ambiante.
- Rincer les lames 3 - 5x avec du tampon TBS (nouse alternativement 10x dilué tampon DAKO).
- Incuber les lames avec un complexe avidine-peroxydase de raifort (HRP) diluée dans la solution de blocage pendant 1 heure à température ambiante.
- Rincer les lames 3 - 5x avec du tampon TBS (utiliser un tampon DAKO alternativement 10x dilué).
7. Visualisation
- La visualisation de l'anticorps secondaire marqué AP lié
- Préparer un tampon 0,1 M de Tris-HCl en dissolvant 12,1 g de Tris dans 1 L dH2Û et ajuster le pH à l'aide de HCl. En utilisant le même tampon Tris-HCl pour préparer une solution 1 M de lévamisole. Préparer fraîchement solution à 4% NaNO2 dans dH 2 O.
- Pour obtenir 50 ml de bleu (FB) substrat rapide (volume requis pour une cuvette de verre standard) dissoudre 6,25 mg Naphtol-AS-MX-Phosphate dans 312,5 pi de DMF dans le tube de verre et remuer dans 50 ml de pré-chauffé (37 ° C) du tampon Tris-HCl. Pour dissoudre 12,5 mg FB RR sel dans 312,5 pi 2 N HCl ajouter 312,5 pi de prepa précédemmentrouge 4% NaNO2 solution et agiter le mélange dans les mêmes 50 ml de tampon Tris-HCl préchauffée. Agiter légèrement jusqu'à ce que le liquide jaune devient clair et enfin ajouter 77 pi de solution préalablement préparée 1 M lévamisole. Filtrat obtenu le mélange et versez sur des lames placées dans la cuvette de verre.
- Initier l'incubation à 37 ° C et de contrôler le développement de processus sous le microscope optique env. toutes les 15 - 30 min. Si tournant floue, remplacer la solution de FB avec le mélange frais.
- Rincer les lames 3 - 5x avec du tampon TBS et le transfert par la suite dans le tampon PBS.
- Visualisation de l'anticorps secondaire biotinylé lié
- Préparer DAB / H 2 O 2 solution de développement en diluant 1 ml DAB solution mère (25 mg DAB par 1 ml PBS) dans 49 ml de PBS. Ajouter 16,5 ul de H 2 O 2 et le filtrat avant de verser sur les sections.
- La conversion du DAB chromogène en front précipitantn pigment peut être immédiate. Contrôler le processus de développement au microscope optique (même de quelques secondes une incubation plus longue peut soulever un bruit de fond élevé et masque le signal spécifique).
- L'intensité du pigment précipité brun peut alternativement être améliorée par une incubation dans la solution constituée de 2% de sulfate de cuivre et 0,9% de NaCl pendant 5 '.
- Rincer les lames 3 - 5x avec du PBS et finalement avec dH 2 O, utiliser alternativement l' eau du robinet.
- Monter les lames avec couvercle glisse directement à partir de l'eau en utilisant un milieu de montage aqueux GelTol. Évitez de créer des bulles d'air.
- Autoriser le séchage complet du support de montage, par exemple, o / n à 4 ° C. Magasin séché diapositives sur RT.
| 1. | % d'éthanol | 20 ' | 40 ° C, |
| 2. | % d'éthanol | 60 &# 39; | 40 ° C, |
| 3. | % d'éthanol | 90 ' | 40 ° C, |
| 4. | % d'éthanol | 60 ' | 40 ° C, |
| 5. | % d'éthanol | 90 ' | 40 ° C, |
| 6. | % d'éthanol | 60 ' | 40 ° C, |
| 7. | % d'éthanol | 90 ' | 40 ° C, |
| 8. | % d'éthanol | 120 ' | 40 ° C, |
| 9. | Xylol | 30 ' | 40 ° C, |
| dix. | Xylol | 60 ' | 40 ° C, |
| 11. | Paraffine | 60 ' | 60 ° C, |
| 12. | Paraffine | 60 ' | 60 ° C, |
| 13. | Paraffine | 60 ' | 60 ° C, |
| 14. | Paraffine | 120 ' | 60 ° C, |
Tableau 1. Traitement des tissus par Tissue-Tek Vacuum VIP Infiltration Processor.
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Résultats
immunomarquages doubles (co-Colorations) ont été réalisées dans fixés au formol, rat de paraffine sections CNS et LN. 3-5 um tranches de tissu d' épaisseur ont été découpées à l' aide d' un microtome de traîneau, monté ensuite sur des lames de verre adhésives pré-enduits et traités comme décrit précédemment 10,11,12. En bref, après déparaffinage, réhydratation des tissus et de la peroxydase endogène, l'inactivation, des sections ont été soumises au processus ...
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Discussion
les procédures IHC standard nécessitent souvent des ajustements spécifiques pour obtenir un résultat optimal, ce qui implique généralement une grande expérience, mais aussi l'approche "essais et erreurs". De la préparation des tissus jusqu'à la visualisation cible, presque chaque étape du protocole peut être soumis à des modifications conçues individuellement afin d'améliorer le résultat final. Double protocole de coloration présenté ici illustre la protéine à base de IHC ciblant particulièrement a...
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Déclarations de divulgation
Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.
Remerciements
Nous remercions Hans Lassmann et Jan Bauer pour leurs conseils et leur soutien. Nous remercions également Katalin Benedek pour l’excellente assistance technique et Caroline Westerlund pour l’évaluation critique et linguistique.
Cette étude a été financée par des subventions de Biogen Idec, de la Fondation Wenner-Gren, du Conseil suédois de la recherche, de l’Association suédoise des personnes atteintes de handicaps neurologiques, de la Fondation suédoise du cerveau, du 6e cadre de l’UE EURATools (LSHG-CT-2005-019015) et de Neuropromise (LSHM-CT-2005-018637). Les bailleurs de fonds n’ont joué aucun rôle dans la conception de l’étude, la collecte et l’analyse des données, la décision de publier ou la préparation du manuscrit.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Réactif | |||
| Isoflurane (Isofluran) : 1-Chlor-2,2,2-trifluoréthyle (éther difluorméthylique) 2-Chlor-2-(difluorméthoxy)-1,1,1-trifluoréthan (C3H2ClF5O) | Baxter | 1001936060 | Irradiation oculaire. Influence probablement la fertilité et endommage le bébé dans l’utérus. Administrer uniquement dans un environnement anesthésiant correctement équipé. |
| Chlorure de sodium (NaCl) | Merck | 1.0604 | |
| Phosphate Tampon Saline (PBS), comprimé | Sigma-Aldrich | P4417 | |
| Paraformaldéhyde (OH(CH2O)nH (n = 8 - 100)), 4 % dans 1x PBS | Apl pharma | 34 24 28 | Danger pour la santé. Corrosif. Inflammable. Toxicité aiguë. |
| Éthanol ≥ ; 99,5 %, absolu (CH3CH2OH) | Sigma-Aldrich | 459844-1L | Inflammable. |
| Xylène (Xylènes, grade histologique ; C6H4(CH3)2 | Sigma-Aldrich | 534056 | Flamable. Toxicité aiguë. |
| Histo-Comp Paraffine Wax | Tissue-Tek | V0-5-1001 | |
| Lames de microscope adhésives | Starfrost | MIC-1040-W | |
| Substitut de xylol XEM-200 | Vogel GmbH | ND-HS-200 | Sensibilisation respiratoire. Cancérogénicité. |
| Souris &alpha ;-CD8 (Ox-8) anti-rat, anticorps primaire | AbD Serotec | MCA48G | |
| &alpha ;-Iba1 (AIF1) souris anti-rat, anticorps primaire | Millipore | MABN92 | |
| &alpha ;-CD68 (ED1) souris anti-rat, anticorps primaire | AbD Serotec | MCA341R | |
| &alpha ;-eotaxine C-19 (CCL11) chèvre anti-rat, anticorps primaire | Santa Cruz BT | SC-6181 | |
| Anticorps secondaire conjugué à la phosphatase alcaline (AP) | Dakopatts, Danemark | D0314 | |
| Anticorps secondaire biotinylé | Amersham Biotech | RPN1025 | |
| Complexe avidine-raifort-peroxydase (HRP) | Sigma-Aldrich | A3151 | |
| Naphtol AS-MX phosphate (C19H18NO5P) | Sigma-Aldrich | N4875-1G | Toxicité aiguë. |
| Sel Fast Blue RR, Azoïque Diazo n° 24 (C15H14ClN3O3 x 1/2 ZnCl2) | Sigma-Aldrich | FBS25 | |
| Chlorhydrate de lévamisol (C11H13ClN2S) | Sigma-Aldrich | 31742 | Toxicité aiguë. |
| Tétrachlorhydrate de 3,3'-diaminobenzidine (DAB Chromogen) | DAKO | S3000 | Hautement inflammable. Toxique. |
| Sulfate de cuivre (CuSO4) | Merck | 1.02791 | Toxicité aiguë. Danger environnemental. |
| GelTol Milieu de montage aqueux | Thermo Electron Corporation | 230100 | |
| Peroxyde d’hydrogène, 30 % (H2O2) | Merck | 107210 | Toxicité aiguë. |
| Méthanol (CH3OH) | Fluka | 65543 | Toxicité aiguë. Sensibilisation respiratoire. Cancérogénicité. Inflammable. |
| Tris (hydroxyméthyl) aminométhane, base TRIS (C4H11NO3 ) | AppliChem | A1379 | Irritation de la peau et des yeux. |
| Tris Saline tamponnée (TBS), comprimé | Sigma-Aldrich | T5030 | |
| Di- Hydrogénophosphate de sodium dihydraté (Na2HPO4 x 2H2O) | Merck | 1.0658 | |
| Dihydrogénophosphate de sodium monohydraté (NaH2PO4 x 1H2O) | Merck | 1.06346 | |
| Sérum de veau fœtal (FCS) | Cambrex BioScience | DE-14-802F | |
| DAKO tampon de lavage de cytomation 10x | DAKO | S3006 | Doit être conservé à 2-8 ° ; C pour inhiber la croissance bactérienne. Évitez la formation de mousse. |
| N,N-diméthylformamide ; DMF (C3H7NO) | Fluka | 40250 | Inflammable. Toxicité aiguë. |
| lamelles en verre 24 x 36 mm | Menzel-Glä ; ser | BB024036A1 | |
| Acide chlorhydrique, conc. (HCl) | Sigma-Aldrich | 30721 | Corrosif, irritant, perméateur. Sensibilisant pulmonaire (sous forme de brouillard acide). Toxique. |
| Solution d’acide chlorhydrique volumétrique, 2 M HCl (2 N) | Fluka | 71826 | Corrosif, irritant, perméateur. Sensibilisant pulmonaire (sous forme de brouillard acide). Toxique. |
| Nitrite de sodium, ReagentPlus, ≥ ; 99,0 % (NaNO2) | Sigma-Aldrich | S2252 | oxydant. Toxique. Dangereux pour l’environnement. |
| Sel disodique de l’acide éthylènedinitrilotétraacétique dihydraté (EDTA ; C10H14N2Na2O8 x 2H2O) | Merck | 1.08454 | L’exposition par voie orale peut avoir des effets sur la reproduction et le développement. |
| Equipment | |||
| >Tissue-TekV.I.P Processeur d’infiltration | sous vide Sakura | 5902 VIP Jr. 115 V, 60 Hz | |
| Hacker-Bright 8000 Series Base Sledge Microtome | Hacker instruments | ||
| Cuiseur vapeur pour aliments ménagers | Braun | MultiGourmet FS 20 | |
| Microscope optique | Leica Polyvar 2 |
Références
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Réimpressions et autorisations
