Generation of Human cardiomyocytes: En Differentiering Protocol fra Feeder-fri Menneskelige induceret pluripotente stamceller

Summary

Pluripotente stamceller, enten embryonale eller induceret pluripotente stamceller (iPS-celler), udgør en værdifuld kilde til humane differentierede celler, herunder cardiomyocytter. Her vil vi fokusere på hjertets induktion af iPS celler, der viser, hvordan man bruger dem til at opnå funktionelle menneskelige cardiomyocytes gennem en embryoid organer-baseret protokol.

Abstract

For at undersøge de begivenheder køre hjerte udvikling og at bestemme de molekylære mekanismer, der fører til myocardiale sygdomme hos mennesker, er det vigtigt først at generere funktionelle humane cardiomyocytter (CMS). Brugen af ​​disse celler i lægemiddelforskning og toksikologiske undersøgelser ville også være meget gavnlig, så nye farmakologiske molekyler til behandling af hjertesygdomme skal valideres præ-klinisk på celler af menneskelig oprindelse. Af de mulige kilder til CMS er induceret pluripotente stamceller (iPS-celler) blandt de mest lovende, da de kan udledes direkte af lettilgængelig patient vævet og har en egentlig kapacitet til at give anledning til alle celletyper i kroppen ^1.. Flere metoder er blevet foreslået til at differentiere iPS celler i CMS, der spænder fra de klassiske embryoid organer (EBS) sammenlægning tilgang til kemisk definerede protokoller ^2,3. I denne artikel vil vi foreslå en EB-baseret protokol, og vise, hvordan dette method kan anvendes til effektivt at generere funktionelle CM-lignende celler fra feeder-fri iPS celler.

Introduction

Historisk set har undersøgelsen af ​​de genetiske og molekylære mekanismer kørsel menneskelig udvikling og sygdom været baseret på generation af genetisk modificerede dyremodeller. Men mange menneskelige fænotyper ikke med held gentaget i mus, primært på grund af de biologiske forskelle mellem de to arter. På den anden side, adgang til humane væv kan begrænses, og ofte ikke nok materiale til at opnås for dybdegående eksperimentelle studier. Feltet af kardiovaskulære biologi lider begge disse begrænsninger: fysiologi af det menneskelige hjerte er væsentligt forskellig fra musen, og en betydelig mængde af hjerte væv er kun tilgængelige post mortem eller under hjerteoperation. Finde en optimal kilde til differentiering af funktionelle menneske CMS er derfor blevet et centralt emne i kardiovaskulær biologi og meget indsats er gjort for at løse dette problem. Forskellige celletyper er blevet foreslået, including skelet myoblaster, lokale hjerte stamceller, knoglemarvsceller mononukleære celler, endotelceller progenitorer og mesenkymale stamceller. Men data opnået ved hjælp af disse celler ikke har været konsekvente ^4..

Udledningen af menneskelige embryonale stamceller (ESC) først ⁵ og banebrydende opdagelse af inducerede pluripotente stamceller (iPS) celler ved Yamanaka og Thomson ^6,7 senere syntes at levere løsninger: Disse celler har evnen til at vokse på ubestemt tid og potentialet til at give stige til alle celle derivater af de tre kimlag, herunder CMS. Anvendelsen af ​​iPS celler giver yderligere fordele: bliver afledt fra autologe voksne celler, de udfører den samme genom som individ eller patient, hvorfra de er afledt. De har derfor mulighed for udvikling af in vitro-modeller, der letter undersøgelse af genetiske sygdomme hos mennesker og mekanismer i udvikling. I kraft af denne egenskab, kan iPS celler også overcome problemer relateret til immun afvisning og etiske spørgsmål ^8.. Af disse grunde, selvom økonomiske og sociale råd udgør stadig guldstandarden inden for stamceller biologi forskere over hele verden bevæger sig nu mere mod iPS-celle teknologi.

iPS celler bliver nu ansat til at modellere menneskelig sygdom in vitro for forskellige forhold, herunder medfødte kardiovaskulære lidelser ^9,10. For nylig har anvendelsen af iPS celle sygdom modellering blevet udført for monogene hjertelidelser (dvs. lange QT-syndrom, katekolaminerge polymorf ventrikulær takykardi) og patologier, hvor hjerte-defekter er en del af en kompleks fænotype (dvs. Leopard og Timothy syndromer, dilaterede kardiomyopati). Disse rapporter bekræftede, at patient-specifikke iPS celler, der er differentieret i CMS viser lignende fænotypiske og funktionelle karakteristika som sygdommen in vivo.

Men derer stadig mange udfordringer for at forbedre effektiviteten af ​​inducere iPS celler i hjertets afstamning. Spontan generation af CMS fra humane økonomiske og sociale råd via samlet formation kaldet embryoid organer (EBS) har vist sig succesfuld ^17.. Siden denne opdagelse, har mange andre metoder blevet foreslået. Mange grupper har i høj grad forbedret effektiviteten af differentiering protokol og har bevæget mod kemisk definerede og animalsk produkt-fri kultur reagenser (se Mummery, C., et al., Circulation Research (2012) for en omfattende gennemgang af alle eksisterende metoder ³ ).

Ikke desto mindre er den klassiske metode baseret på EB sammenlægning udgør fortsat den mest almindeligt anvendte til at udføre funktionelle undersøgelser og efterforskning sygdomsmekanismer. Vores foreslåede protokol er baseret på aggregering af iPS celler i EB'er og kultur i nærvær af serum og ascorbinsyre, der har vist sig at forbedre hjerte-differentiering proces og positively påvirke modningen af disse celler ^18,19. I denne artikel vil vi gå gennem denne metode i detaljer og vil vise, hvordan man bruger feeder-fri iPS cellelinier til at generere patient-specifikke iPS-afledt CMS.

Protocol

1.. Feeder-fri Vedligeholdelse og Passaging Menneskerettighedsdomstols iPS cellelinier Forbered Matrigelcoatede retter. Thaw et hætteglas med human ESC-kvalificeret Matrix på is i en time og fortynde det i 25 ml DMEM-F12 medium. Tilsæt 1 ml til hver 35 mm plade (eller tilsvarende beløb pr areal, hvis andre retter er brugt), holde alt på is og sikre, at alle plader og rør er præ-afkølet. Dækplader med aluminiumsfolie. Bemærk: Matrigel lager koncentr…

Representative Results

I vores studier har vi genereret CMS fra flere iPS cellelinier. Disse linjer blev oprindeligt genereret på en MEF feeder lag, men blev straks placeret på Matrigel ved hjælp af et defineret medium (enten mTESR1 eller Nutristem). Forskellige assays blev anvendt til at verificere vedligeholdelse af de morfologiske egenskaber, ekspressionen af markører typiske pluripotente celler (OLT-4, SSEA4 og TRA1-60) og deres genom stabilitet (figur 1). Induktion i hjertets afstamning b…

Discussion

Pluripotente stamceller har potentiale til at differentiere spontant i CMS, omend med lav effektivitet og høj variabilitet blandt linjer. Udviklingen af ​​nye induktionsmetoder har derfor fokuseret på at forbedre effektiviteten af ​​processen og bevæger sig mod mere definerede protokoller. Men de fleste af disse nye differentiering metoder er ganske komplekse, kræver udførlige dyrkningsbetingelser, finkontrol af timing og koncentration af reagenser, og behandling med dyre cytokiner og vækstfaktorer. Også …

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
			Media and Reagents
Human ESC-qualified Matrix	BD Biosciences	354277	Thaw the 5 ml bottle at 4 °C on ice O/N, aliquot in pre-chilled cryo-tubes on ice, according to the data sheet dilution instructions and store at -20 °C .
Fibronectin, from human plasma, 0.1% solution	Sigma	F0896-2MG	Working concentration: 5 μg/cm2
Laminin	Sigma	L2020-1MG	Working concentration: 5 μg/cm2
PBS (no Mg and Ca), 10X	Lonza	BE17-515F
PBS (with Mg and Ca), 10X	Bio Sera	XC-S2067/500
Dispase II, neutral protease, grade II	Roche	4942078001	Stock: 10 mg/ml in DMEM-F12 at -20 °C, working solution: 1 mg/ml in PBS (no Mg/Ca)
Trypsin/EDTA, 0.5%	Sigma	T3924
Collagenase type 2	Worthington	4176	Dilute to 480 U/ml (e.g. 1.6 mg/ml) in PBS with Mg and Ca
DMEM-F12	Life Technologies	21331-020
Knockout DMEM	Life Technologies	10829-018
Knockout Serum Replacement (KSR)	Life Technologies	10828-028	Thaw at 4 °C, aliquot and store at -20 °C
Foetal Bovine Serum (origin South America)	Invitrogen	10270-106	Batches should be tested for their cardiogenic potential. Thaw at 4 °C, heat-inactivate at 56 °C for 30 min, aliquot and store at -20 °C
PenStrep, penicillin-Streptomycin, 100X	Life Technologies	15140-122
GlutaMAX, 100X	Life Technologies	35050-038
MEM NEAA, 100X	Invitrogen	11140-135
N2 supplement, 100X	Life Technologies	17502-048
B27 supplement, 50X	Life Technologies	12587-010
2-mercaptoethanol	Invitrogen	31350-010
Gelatin, from porcine skin	Sigma	G1890-100G	Make stock at 1% in water, store at -20 °C. Dilute to 0.1% in PBS and keep at 4 °C
mTeSR1	Stem Cell Technologies	5850	Combine Supplement 5X with the basic medium, aliquot and store at -20 °C. Do not keep complete medium at 4 °C for more than 1 week
Nutristem hESC XF	Stemgent from Biological Industries	05-100-1A	Thaw at 4 °C O/N, aliquot and store at -20 °C until use. Aliquots may be kept at 4 °C for no more than a week.
mFreSR	Stem Cell Technologies	5853
Ascorbic acid	Sigma	A4544-25G	Prepare stocks at 10 mg/ml in water. Store aliquots at -20 °C in the dark. Add to EBM at the final concentration (500X)
			Plasticware
35 mm culture dishes	Becton Dickinson	353001
Cell scraper	Corning Incorporated	3008
12-well plates	Becton Dickinson	353043
Permanox 2-well chamber slides	Thermo Fisher Scientific	177437
Glass 2-well chamber slides	Thermo Fisher Scientific	177380
6-well plates, ultra-low-attachment surface	Corning Incorporated	3471
18G needle	Becton Dickinson	304622
Glass pasteur pipettes, 230 mm	VWR International	612-1702
2.5 ml syringe	Becton Dickinson	300188
			Equipments
IVF Workstation	KSystem, by Nikon
Nikon SMZ1500 Stereomicroscope	Nikon