Pluripotente stamceller, enten embryonale eller induceret pluripotente stamceller (iPS-celler), udgør en værdifuld kilde til humane differentierede celler, herunder cardiomyocytter. Her vil vi fokusere på hjertets induktion af iPS celler, der viser, hvordan man bruger dem til at opnå funktionelle menneskelige cardiomyocytes gennem en embryoid organer-baseret protokol.
For at undersøge de begivenheder køre hjerte udvikling og at bestemme de molekylære mekanismer, der fører til myocardiale sygdomme hos mennesker, er det vigtigt først at generere funktionelle humane cardiomyocytter (CMS). Brugen af disse celler i lægemiddelforskning og toksikologiske undersøgelser ville også være meget gavnlig, så nye farmakologiske molekyler til behandling af hjertesygdomme skal valideres præ-klinisk på celler af menneskelig oprindelse. Af de mulige kilder til CMS er induceret pluripotente stamceller (iPS-celler) blandt de mest lovende, da de kan udledes direkte af lettilgængelig patient vævet og har en egentlig kapacitet til at give anledning til alle celletyper i kroppen 1.. Flere metoder er blevet foreslået til at differentiere iPS celler i CMS, der spænder fra de klassiske embryoid organer (EBS) sammenlægning tilgang til kemisk definerede protokoller 2,3. I denne artikel vil vi foreslå en EB-baseret protokol, og vise, hvordan dette method kan anvendes til effektivt at generere funktionelle CM-lignende celler fra feeder-fri iPS celler.
Historisk set har undersøgelsen af de genetiske og molekylære mekanismer kørsel menneskelig udvikling og sygdom været baseret på generation af genetisk modificerede dyremodeller. Men mange menneskelige fænotyper ikke med held gentaget i mus, primært på grund af de biologiske forskelle mellem de to arter. På den anden side, adgang til humane væv kan begrænses, og ofte ikke nok materiale til at opnås for dybdegående eksperimentelle studier. Feltet af kardiovaskulære biologi lider begge disse begrænsninger: fysiologi af det menneskelige hjerte er væsentligt forskellig fra musen, og en betydelig mængde af hjerte væv er kun tilgængelige post mortem eller under hjerteoperation. Finde en optimal kilde til differentiering af funktionelle menneske CMS er derfor blevet et centralt emne i kardiovaskulær biologi og meget indsats er gjort for at løse dette problem. Forskellige celletyper er blevet foreslået, including skelet myoblaster, lokale hjerte stamceller, knoglemarvsceller mononukleære celler, endotelceller progenitorer og mesenkymale stamceller. Men data opnået ved hjælp af disse celler ikke har været konsekvente 4..
Udledningen af menneskelige embryonale stamceller (ESC) først 5 og banebrydende opdagelse af inducerede pluripotente stamceller (iPS) celler ved Yamanaka og Thomson 6,7 senere syntes at levere løsninger: Disse celler har evnen til at vokse på ubestemt tid og potentialet til at give stige til alle celle derivater af de tre kimlag, herunder CMS. Anvendelsen af iPS celler giver yderligere fordele: bliver afledt fra autologe voksne celler, de udfører den samme genom som individ eller patient, hvorfra de er afledt. De har derfor mulighed for udvikling af in vitro-modeller, der letter undersøgelse af genetiske sygdomme hos mennesker og mekanismer i udvikling. I kraft af denne egenskab, kan iPS celler også overcome problemer relateret til immun afvisning og etiske spørgsmål 8.. Af disse grunde, selvom økonomiske og sociale råd udgør stadig guldstandarden inden for stamceller biologi forskere over hele verden bevæger sig nu mere mod iPS-celle teknologi.
iPS celler bliver nu ansat til at modellere menneskelig sygdom in vitro for forskellige forhold, herunder medfødte kardiovaskulære lidelser 9,10. For nylig har anvendelsen af iPS celle sygdom modellering blevet udført for monogene hjertelidelser (dvs. lange QT-syndrom, katekolaminerge polymorf ventrikulær takykardi) og patologier, hvor hjerte-defekter er en del af en kompleks fænotype (dvs. Leopard og Timothy syndromer, dilaterede kardiomyopati). Disse rapporter bekræftede, at patient-specifikke iPS celler, der er differentieret i CMS viser lignende fænotypiske og funktionelle karakteristika som sygdommen in vivo.
Men derer stadig mange udfordringer for at forbedre effektiviteten af inducere iPS celler i hjertets afstamning. Spontan generation af CMS fra humane økonomiske og sociale råd via samlet formation kaldet embryoid organer (EBS) har vist sig succesfuld 17.. Siden denne opdagelse, har mange andre metoder blevet foreslået. Mange grupper har i høj grad forbedret effektiviteten af differentiering protokol og har bevæget mod kemisk definerede og animalsk produkt-fri kultur reagenser (se Mummery, C., et al., Circulation Research (2012) for en omfattende gennemgang af alle eksisterende metoder 3 ).
Ikke desto mindre er den klassiske metode baseret på EB sammenlægning udgør fortsat den mest almindeligt anvendte til at udføre funktionelle undersøgelser og efterforskning sygdomsmekanismer. Vores foreslåede protokol er baseret på aggregering af iPS celler i EB'er og kultur i nærvær af serum og ascorbinsyre, der har vist sig at forbedre hjerte-differentiering proces og positively påvirke modningen af disse celler 18,19. I denne artikel vil vi gå gennem denne metode i detaljer og vil vise, hvordan man bruger feeder-fri iPS cellelinier til at generere patient-specifikke iPS-afledt CMS.
Pluripotente stamceller har potentiale til at differentiere spontant i CMS, omend med lav effektivitet og høj variabilitet blandt linjer. Udviklingen af nye induktionsmetoder har derfor fokuseret på at forbedre effektiviteten af processen og bevæger sig mod mere definerede protokoller. Men de fleste af disse nye differentiering metoder er ganske komplekse, kræver udførlige dyrkningsbetingelser, finkontrol af timing og koncentration af reagenser, og behandling med dyre cytokiner og vækstfaktorer. Også …
The authors have nothing to disclose.
BS blev støttet af universitetet i Milano-Bicocca Summer Student Research Training Program, forskning blev støttet med midler fra det italienske sundhedsministerium og italienske undervisningsministerium, universiteter og forskning og Fondazione Humanitas til GC, vi takker Michael VG Latronico for kritisk læsning af manuskript.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
Media and Reagents | |||
Human ESC-qualified Matrix | BD Biosciences | 354277 | Thaw the 5 ml bottle at 4 °C on ice O/N, aliquot in pre-chilled cryo-tubes on ice, according to the data sheet dilution instructions and store at -20 °C . |
Fibronectin, from human plasma, 0.1% solution | Sigma | F0896-2MG | Working concentration: 5 μg/cm2 |
Laminin | Sigma | L2020-1MG | Working concentration: 5 μg/cm2 |
PBS (no Mg and Ca), 10X | Lonza | BE17-515F | |
PBS (with Mg and Ca), 10X | Bio Sera | XC-S2067/500 | |
Dispase II, neutral protease, grade II | Roche | 4942078001 | Stock: 10 mg/ml in DMEM-F12 at -20 °C, working solution: 1 mg/ml in PBS (no Mg/Ca) |
Trypsin/EDTA, 0.5% | Sigma | T3924 | |
Collagenase type 2 | Worthington | 4176 | Dilute to 480 U/ml (e.g. 1.6 mg/ml) in PBS with Mg and Ca |
DMEM-F12 | Life Technologies | 21331-020 | |
Knockout DMEM | Life Technologies | 10829-018 | |
Knockout Serum Replacement (KSR) | Life Technologies | 10828-028 | Thaw at 4 °C, aliquot and store at -20 °C |
Foetal Bovine Serum (origin South America) | Invitrogen | 10270-106 | Batches should be tested for their cardiogenic potential. Thaw at 4 °C, heat-inactivate at 56 °C for 30 min, aliquot and store at -20 °C |
PenStrep, penicillin-Streptomycin, 100X | Life Technologies | 15140-122 | |
GlutaMAX, 100X | Life Technologies | 35050-038 | |
MEM NEAA, 100X | Invitrogen | 11140-135 | |
N2 supplement, 100X | Life Technologies | 17502-048 | |
B27 supplement, 50X | Life Technologies | 12587-010 | |
2-mercaptoethanol | Invitrogen | 31350-010 | |
Gelatin, from porcine skin | Sigma | G1890-100G | Make stock at 1% in water, store at -20 °C. Dilute to 0.1% in PBS and keep at 4 °C |
mTeSR1 | Stem Cell Technologies | 5850 | Combine Supplement 5X with the basic medium, aliquot and store at -20 °C. Do not keep complete medium at 4 °C for more than 1 week |
Nutristem hESC XF | Stemgent from Biological Industries | 05-100-1A | Thaw at 4 °C O/N, aliquot and store at -20 °C until use. Aliquots may be kept at 4 °C for no more than a week. |
mFreSR | Stem Cell Technologies | 5853 | |
Ascorbic acid | Sigma | A4544-25G | Prepare stocks at 10 mg/ml in water. Store aliquots at -20 °C in the dark. Add to EBM at the final concentration (500X) |
Plasticware | |||
35 mm culture dishes | Becton Dickinson | 353001 | |
Cell scraper | Corning Incorporated | 3008 | |
12-well plates | Becton Dickinson | 353043 | |
Permanox 2-well chamber slides | Thermo Fisher Scientific | 177437 | |
Glass 2-well chamber slides | Thermo Fisher Scientific | 177380 | |
6-well plates, ultra-low-attachment surface | Corning Incorporated | 3471 | |
18G needle | Becton Dickinson | 304622 | |
Glass pasteur pipettes, 230 mm | VWR International | 612-1702 | |
2.5 ml syringe | Becton Dickinson | 300188 | |
Equipments | |||
IVF Workstation | KSystem, by Nikon | ||
Nikon SMZ1500 Stereomicroscope | Nikon |