Generation of Human Cardiomyocytes: En Differensiering Protokoll fra mater-frie menneskeskapte pluripotent stamceller

Summary

Pluripotente stamceller, enten embryonale eller indusert pluripotente stamceller (iPS) celler, utgjør en verdifull kilde til menneskelige differensierte celler, inkludert cardiomyocytes. Her vil vi fokusere på hjertestans induksjon av iPS-celler, som viser hvordan du bruker dem til å oppnå funksjonelle menneskelige cardiomyocytes gjennom en embryoid organer-basert protokoll.

Abstract

For å undersøke hendelsene kjøring hjerte utvikling og for å bestemme de molekylære mekanismene som fører til hjerteinfarkt sykdommer hos mennesker, er det viktig først å generere funksjonelle menneskelige cardiomyocytes (CMS). Bruken av disse celler i medisiner og toksikologiske studier ville også være meget gunstig, slik at nye farmakologiske molekyler for behandling av hjertesykdommer som skal valideres pre-klinisk på celler av human opprinnelse. Av de mulige kilder til CMS, pluripotent spindelen (IPS) celler er blant de mest lovende, da de kan utledes direkte fra lett tilgjengelige pasientens vev og har en iboende evne til å gi opphav til alle celletyper i kroppen ^1.. Flere metoder har blitt foreslått for å differensiere iPS celler inn i CMS, som spenner fra de klassiske embryoid organer (EBS) aggregering tilnærming til kjemisk definerte protokoller ^2,3. I denne artikkelen foreslår vi en EBS-basert protokoll og vise hvordan dette method kan brukes til å effektivt generere funksjonelle CM-lignende celler fra mater-frie iPS celler.

Introduction

Historisk har etterforskningen av de genetiske og molekylære mekanismer som driver menneskelig utvikling og sykdom vært basert på produksjon av genmodifiserte dyremodeller. Imidlertid tallrike humane fenotyper ikke klarer å være vellykket replikeres i mus, hovedsakelig på grunn av de biologiske forskjeller som eksisterer mellom de to artene. På den annen side, tilgang på humant vev kan være begrenset og ofte ikke tillate nok materiale til å bli oppnådd for inngående eksperimentelle studier. Feltet av kardiovaskulære biologi lider av begge disse begrensninger: fysiologien av det menneskelige hjerte er vesentlig forskjellig fra den i mus, og en betydelig mengde av hjertevev er tilgjengelig bare obduksjon eller under hjertekirurgi. Finne en optimal kilde for differensiering av funksjonelle menneskelig CMS har derfor blitt et sentralt tema i kardiovaskulær biologi, og mye arbeid er gjort for å løse dette problemet. Forskjellige typer celler er blitt foreslått, including skjelettlidelser myoblasts, lokale kardiale stamceller, benmarg mononukleære celler, endotelceller forfedre og stamceller. Imidlertid oppnådde data ved hjelp av disse celler ikke har vært konsekvent ^4..

Avledning av humane embryonale stamceller (ESC) første ⁵ og banebrytende oppdagelse av induserte pluripotente stamceller (iPS) celler ved Yamanaka og Thomson ^6,7 senere syntes å tilby løsninger: Disse cellene har evnen til å vokse på ubestemt tid og potensial til å gi stige til alle celle derivater av de tre bakterie lag, herunder det CMS. Bruken av iPS celler gir ytterligere fordeler: å være avledet fra autologe voksne celler, bærer de samme genom som den enkelte pasient eller fra hvilket de er avledet. De har derfor tillate utviklingen av in vitro modeller som letter etterforskningen av menneskelige genetiske sykdommer og mekanismer for utvikling. I kraft av denne karakteristiske, kan iPS celler også overcome problemer knyttet til immunforsvaret avvisning og etiske problemstillinger ^åtte. For disse grunner, selv om ESCs fortsatt representerer gullstandarden innen stamcelleforskningen biologi, er forskere over hele verden nå beveger seg mer mot iPS celle teknologi.

iPS celler blir nå ansatt for å modellere menneskelige sykdommer in vitro for ulike forhold, inkludert medfødte kardiovaskulære lidelser ^9,10. Nylig har anvendelsen av iPS celle sykdom modellering utført for monogene hjertesykdommer (dvs. lang QT syndromer, catecholaminergic polymorf ventrikulær takykardi) og sykdomstrekk der kardiale defekter er en del av en kompleks fenotype (dvs. Leopard og Timothy syndromer, dilatert kardiomyopati). Disse rapportene bekreftet at pasient-spesifikke iPS celler som skiller seg inn i CMS vise lignende fenotypiske og funksjonelle egenskaper som sykdommen in vivo.

Men deter fortsatt mange utfordringer for å forbedre effekten av å indusere iPS celler i hjertets avstamning. Spontan generasjon av CMS fra menneskelige ESCs via aggregatdannelse kalt embryoid organer (EBS) har vist seg vellykket ^17. Siden denne oppdagelsen, har mange andre metoder blitt foreslått. Mange grupper har kraftig forbedret effektiviteten av differensiering protokollen og har beveget seg mot kjemisk definerte og animalske biprodukt-fri kultur reagenser (se Mummery, C., et al., Circulation Forskning (2012) for en omfattende gjennomgang av alle eksisterende metoder ³ ).

Ikke desto mindre representerer den klassiske metoden basert på EB aggregering fremdeles den mest vanligvis anvendt for å utføre funksjonelle studier og undersøke sykdom mekanismer. Vår foreslåtte protokoll er basert på aggregering av celler inn i iPS EBS og kultur i nærvær av serum og askorbinsyre, som har vist seg å øke den kardiale differensi og til positively påvirke modningen av disse cellene ^18,19. I denne artikkelen vil vi gå gjennom denne metodikken i detalj og vil vise hvordan du bruker mater-frie iPS cellelinjer for generering av pasient-spesifikke iPS-avledet CMS.

Protocol

En. Feeder-free Vedlikehold og passaging of Human iPS cellelinjer Forbered Matrigel-belagte retter. Tine ett hetteglass av menneskelig ESC-kvalifisert Matrix på is i en time og spe den i 25 ml DMEM-F12 medium. Tilsett 1 ml til hver 35 mm plate (eller tilsvarende beløp per areal hvis andre retter er brukt), holder alt på is og sikre at alle plater og rør er pre-avkjølt. Dekke platene med aluminiumsfolie. Merk: matrigel lager konsentrasjonene varierer fra…

Representative Results

I våre studier genererte vi CMS fra flere iPS cellelinjer. Disse linjene ble opprinnelig generert på en MEF mater lag, men ble umiddelbart plassert på Matrigel ved hjelp av en definert medium (enten mTESR1 eller Nutristem). Forskjellige analyser ble brukt for å verifisere vedlikehold av de morfologiske egenskaper er uttrykk for markører som er typiske for pluripotente celler (OKT-4, SSEA4 og TRA1-60) og deres genom stabilitet (figur 1). Induksjon i hjertets avstamning b…

Discussion

Pluripotente stamceller har potensial til å differensiere spontant inn i CMS, riktignok med lav effektivitet og høy variasjon blant linjene. Utvikling av nye metoder for igangsetting har derfor fokusert på effektivisering av prosessen og beveger seg mot mer definerte protokoller. Men de fleste av disse nye differensieringsmetodane er ganske komplisert, krever forseggjorte dyrkningsbetingelser, finkontroll av timing og konsentrasjon av reagenser, og behandling med dyre cytokiner og vekstfaktorer. Også, forskjeller i …

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
			Media and Reagents
Human ESC-qualified Matrix	BD Biosciences	354277	Thaw the 5 ml bottle at 4 °C on ice O/N, aliquot in pre-chilled cryo-tubes on ice, according to the data sheet dilution instructions and store at -20 °C .
Fibronectin, from human plasma, 0.1% solution	Sigma	F0896-2MG	Working concentration: 5 μg/cm2
Laminin	Sigma	L2020-1MG	Working concentration: 5 μg/cm2
PBS (no Mg and Ca), 10X	Lonza	BE17-515F
PBS (with Mg and Ca), 10X	Bio Sera	XC-S2067/500
Dispase II, neutral protease, grade II	Roche	4942078001	Stock: 10 mg/ml in DMEM-F12 at -20 °C, working solution: 1 mg/ml in PBS (no Mg/Ca)
Trypsin/EDTA, 0.5%	Sigma	T3924
Collagenase type 2	Worthington	4176	Dilute to 480 U/ml (e.g. 1.6 mg/ml) in PBS with Mg and Ca
DMEM-F12	Life Technologies	21331-020
Knockout DMEM	Life Technologies	10829-018
Knockout Serum Replacement (KSR)	Life Technologies	10828-028	Thaw at 4 °C, aliquot and store at -20 °C
Foetal Bovine Serum (origin South America)	Invitrogen	10270-106	Batches should be tested for their cardiogenic potential. Thaw at 4 °C, heat-inactivate at 56 °C for 30 min, aliquot and store at -20 °C
PenStrep, penicillin-Streptomycin, 100X	Life Technologies	15140-122
GlutaMAX, 100X	Life Technologies	35050-038
MEM NEAA, 100X	Invitrogen	11140-135
N2 supplement, 100X	Life Technologies	17502-048
B27 supplement, 50X	Life Technologies	12587-010
2-mercaptoethanol	Invitrogen	31350-010
Gelatin, from porcine skin	Sigma	G1890-100G	Make stock at 1% in water, store at -20 °C. Dilute to 0.1% in PBS and keep at 4 °C
mTeSR1	Stem Cell Technologies	5850	Combine Supplement 5X with the basic medium, aliquot and store at -20 °C. Do not keep complete medium at 4 °C for more than 1 week
Nutristem hESC XF	Stemgent from Biological Industries	05-100-1A	Thaw at 4 °C O/N, aliquot and store at -20 °C until use. Aliquots may be kept at 4 °C for no more than a week.
mFreSR	Stem Cell Technologies	5853
Ascorbic acid	Sigma	A4544-25G	Prepare stocks at 10 mg/ml in water. Store aliquots at -20 °C in the dark. Add to EBM at the final concentration (500X)
			Plasticware
35 mm culture dishes	Becton Dickinson	353001
Cell scraper	Corning Incorporated	3008
12-well plates	Becton Dickinson	353043
Permanox 2-well chamber slides	Thermo Fisher Scientific	177437
Glass 2-well chamber slides	Thermo Fisher Scientific	177380
6-well plates, ultra-low-attachment surface	Corning Incorporated	3471
18G needle	Becton Dickinson	304622
Glass pasteur pipettes, 230 mm	VWR International	612-1702
2.5 ml syringe	Becton Dickinson	300188
			Equipments
IVF Workstation	KSystem, by Nikon
Nikon SMZ1500 Stereomicroscope	Nikon