Sammen Analyser for Monitoring Protein Refolding i<em> Saccharomyces cerevisiae</em
Summary
Denne artikkelen beskriver bruken av et ildflue luciferase-GFP fusjonsprotein for å undersøke<em> In vivo</em> Proteinfolding i<em> Saccharomyces cerevisiae</em>. Ved hjelp av denne reagensen, refolding av en modell varmedenaturert protein kan overvåkes samtidig av fluorescens mikroskopi og en enzymatisk analyse for å undersøke rollene til proteostasis nettverkskomponenter i protein kvalitetskontroll.
Abstract
Proteostasis, definert som de samlede prosesser av protein folding / biogenesis, er refolding / reparasjon, og fornedrelse, en delikat mobilnettet balanse som må opprettholdes for å unngå skadelige konsekvenser en. Eksterne eller interne faktorer som forstyrrer denne balansen kan føre til protein aggregering, giftighet og celledød. Hos mennesker er dette en viktig medvirkende faktor til symptomer assosiert med nevrodegenerative sykdommer slik som Huntingtons, Parkinsons, og Alzheimers sykdom 10. Det er derfor essensielt at proteinene som er involvert i opprettholdelse av proteostasis bli identifisert for å utvikle behandlinger for disse ødeleggende sykdommer. Denne artikkelen beskriver teknikker for overvåking in vivo protein folding på nær sanntid oppløsning ved hjelp av modellen protein ildflue luciferase smeltet til grønt fluorescerende protein (FFL-GFP). FFL-GFP er en unik modell kimært protein som FFL-delen er ekstremt følsomme for stress-indusert misfolding og aggregering, som inaktiverer enzymet 12. Luciferase aktivitet blir overvåket ved hjelp av en enzymatisk assay, og GFP-delen tilveiebringer en metode for visualisering av løselige eller aggregert ferdig gulv ved hjelp av mikroskopi. Disse koblede metoder innlemme to parallelle og teknisk uavhengige tilnærminger til å analysere både refolding og funksjonell reaktivering av et enzym etter stress. Aktivitet utvinning kan være direkte korrelert med kinetikk disaggregation og re-solubilisering å bedre forstå hvordan protein kvalitetskontroll faktorer som protein anstand samarbeide for å utføre disse funksjonene. I tillegg kan genet delesjoner eller mutasjoner brukes til å teste bidrag av spesifikke proteiner eller protein subenheter være denne prosessen. I denne artikkelen undersøker vi de bidragene av protein disaggregase 13 Hsp104, kjent for å samarbeide med Hsp40/70/nucleotide utveksling faktor (NEF) refolding system 5, til protein refolding å validere denne tilnærmingen.
Introduction
Hos mennesker neurodegenerative lidelser, inkludert Alzheimers, Parkinsons og Huntingtons sykdommer har vært knyttet til protein misfolding og aggregering 10.. Celler benytter molekylære anstand for å hindre kinetisk fangst av cellulære proteiner til misfolded inaktive strukturer seks. Anstand delta i intrikate interaksjon nettverk i cellen, men det er ikke helt forstått hvordan summen av disse interaksjonene bidrar til organismebiologi proteostasis. En av de viktigste anstand ansvarlig for flertallet av cytosolprotein folding er 70 kD heat shock protein (Hsp70) familie 19. Det har vist seg at i gjær tap av hsp70 avtar evnen til å kaste begynnende heterologt uttrykt FFL og refold den endogene protein, ornitin transcarbamoylase, i 18 vivo, 7. Evnen til å analysere folding med nær sanntid oppløsning vil lette forståelsen av hvordan ekstra cellulære faktorer fortsribute til denne Hsp70-avhengig prosess. I tillegg kan folding / refolding reaksjonene ikke være helt avhengig av at disse bidrar proteiner, så assay skal være følsom nok til å detektere både store og små endringer i kinetikk og effektivitet.
Gjærcellen disaggregase, Hsp104, spiller en viktig rolle i å reparere aggregerte misfolded proteiner. Selv Hsp104 homologene har blitt identifisert i sopp og planter, synes denne familien til å være fraværende i metazoans. Det har vært foreslått at andre anstand som de av Hsp110 familien utføre noen av de kjente Hsp104 aktiviteter i pattedyr 16. Hsp104 er en AAA +, heksamere protein kompleks som fungerer i gjær til oppussing protein aggregater, som bidrar til refolding og reparasjon 13. Hsp104, sammen med gjær Hsp70, Ssa1, og gjær-Hsp40, Ydj1, er nødvendig for gjenvinning av denaturert OFF i gjærceller 5, 8. Den lille varmesjokkprotein, Hsp26, har også vist seg å være krav som stillesred for Hsp104-mediert disaggregation av FFL to.
OFF er en to-domene protein som binder substratet luciferin i det aktive sete, og etter en konformasjonsendring som krever ATP og oksygen, decarboxylates substratet slippe oxyluciferin, karbondioksyd (CO 2), adenosin-monofosfat (AMP), og lys 11, 9, 3. Den kommersielt tilgjengelige FFL underlaget, D-luciferin, resulterer i lys utslipp mellom 550-570 nm som kan oppdages ved hjelp av en luminometer 15. FFL er utsøkt sensitive til denaturering fra kjemiske eller varme behandlinger og aggregater raskt ved utfoldelse. Når de utsettes for temperaturer mellom 39-45 ° C FFL er reversibelt utfoldet og inaktivert 12. I kontrast, GFP og dets derivater er meget motstandsdyktig mot protein utfolding påkjenninger 14. Derfor fusjon av disse to proteinene gjør FFL å fungere som et eksperimentelt labile delen stand til å sikte funksjonell GFP til intracellulær forekomster som kan visualiseres ved hjelp av fluorescens mikroskopi på både befolkningen og encellede nivåer. Anvendelse av den enzymatiske analyse i en semi-automatisert multimodusfiber plateavleseren kombinert med automatisert enestående mikroskopi tillater simultan evaluering av kinetikk og et utbytte på refolding reaksjoner. I tillegg gir de lettvinte molekylær genetikk av modellen eukaryote Saccharomyces cerevisiae både presis manipulering av protein kvalitetskontroll nettverk og mulighet for oppdagelsen tilnærminger for å identifisere nye spillere som bidrar til mobilnettet stressrespons og proteostasis.
I denne studien, vill type (WT) og HSP104 sletting stammer som uttrykker FFL-GFP er underlagt protein denaturering heat shock. FFL-GFP refolding følges opp gjennom både en enzymatisk analyse og mikroskopi som en proxy avlesning for reparasjon av uttrykte proteomet over en restitusjonstid kurset. Sammenlignet med WT celler, viser vi the Hsp104 sletting belastningen er ~ 60% mindre effektiv ved refolding FFL-GFP, støtter tidligere funn etablere en rolle for Hsp104 i reaktivering av denaturert FFL to.
Protocol
Representative Results
Discussion
I denne artikkelen modellen protein FFL-GFP ble brukt til å vise at gjær disaggregase, bidrar Hsp104 til protein re-solubilisering og reparasjon. Den enzymatiske assayer og mikroskopi differensielt avlest status for den samme substrat protein for å bestemme effektiviteten av utbyttet refolding. Resultater av de enzymatiske assayer utvinning tyder på at ikke bare er den maksimale bedring i hsp104D mutantstammen ineffektiv, men den opprinnelige størrelsen av den etterfølgende belastning var større i den mu…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av et stipend fra National Institutes of Health (NIGMS-074696) til KAM og American Society of Microbiology Robert D. Watkins Graduate Student Research Fellowship til JLA Vi takker også John Glover ved University of Toronto for å gi FFL -GFP kilde plasmid.
Materials
| Reagents | |||
| Synergy MX Microplate Reader | BioTek | ||
| Olympus IX81-ZDC Confocal Inverted Microscope | Olympus, Tokyo Japan | ||
| Lumitrac 200 white 96-well plates | USA Scientific | ||
| SlideBook 5.0 digital microscopy software | Intelligent Imaging Innovations, Inc. Denver, CO, USA | ||
| Equipment | |||
| Tris Base | Fisher | BP152-1 | |
| (LiAc) Lithium Acetate | Sigma | L6883 | |
| PEG (polyethelene glycol) | Fisher | BP233-1 | |
| EDTA | Fisher | BP120-1 | |
| DMSO | Malinckrodt | 4948 | |
| SC | Sunrise | 1300-030 | |
| SC-URA | Sunrise | 1306-030 | |
| cycloheximide | Acros Organics | 357420050 | |
| D-luciferin | Sigma | L9504 | |
| low melt agarose | NuSieve | 50082 | |
| immersion oil | Cargille | 16484 |
References
- Balch, W. E., Morimoto, R. I., Dillin, A., Kelly, J. W. Adapting proteostasis for disease intervention. Science. 319, 916-919 (2008).
- Cashikar, A. G., Duennwald, M., Lindquist, S. L. A chaperone pathway in protein disaggregation. Hsp26 alters the nature of protein aggregates to facilitate reactivation by Hsp104. J. Biol. Chem. 280, 23869-23875 (2005).
- Conti, E., Lloyd, L. F., Akins, J., Franks, N. P., Brick, P. Crystallization and preliminary diffraction studies of firefly luciferase from Photinus pyralis. Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 52, 876-878 (1996).
- Gietz, R. D., Schiestl, R. H., Willems, A. R., Woods, R. A. Studies on the transformation of intact yeast cells by the LiAc/SS-DNA/PEG procedure. Yeast. 11, 355-360 (1995).
- Glover, J. R., Lindquist, S. Hsp104, Hsp70, and Hsp40: a novel chaperone system that rescues previously aggregated proteins. Cell. 94, 73-82 (1998).
- Grantcharova, V., Alm, E. J., Baker, D., Horwich, A. L. Mechanisms of protein folding. Curr. Opin. Struct. Biol. 11, 70-82 (2001).
- Kim, S., Schilke, B., Craig, E. A., Horwich, A. L. Folding in vivo of a newly translated yeast cytosolic enzyme is mediated by the SSA class of cytosolic yeast Hsp70 proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 12860-12865 (1998).
- Lum, R., Niggemann, M., Glover, J. R. Peptide and protein binding in the axial channel of Hsp104. Insights into the mechanism of protein unfolding. J. Biol. Chem. 283, 30139-30150 (2008).
- Marques, S. M., Esteves da Silva, J. C. Firefly bioluminescence: a mechanistic approach of luciferase catalyzed reactions. IUBMB Life. 61, 6-17 (2009).
- Morimoto, R. I. The heat shock response: systems biology of proteotoxic stress in aging and disease. Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 76, 91-99 (2011).
- Nakatsu, T., et al. Structural basis for the spectral difference in luciferase bioluminescence. Nature. 440, 372-376 (2006).
- Nathan, D. F., Vos, M. H., Lindquist, S. In vivo functions of the Saccharomyces cerevisiae Hsp90 chaperone. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 12949-12956 (1997).
- Parsell, D. A., Kowal, A. S., Singer, M. A., Lindquist, S. Protein disaggregation mediated by heat-shock protein Hsp104. Nature. 372, 475-478 (1994).
- Penna, T. C., Ishii, M., Junior, A. P., Cholewa, O. Thermal stability of recombinant green fluorescent protein (GFPuv) at various pH values. Appl. Biochem. Biotechnol. , 113-116 (2004).
- Seliger, H. H., Buck, J. B., Fastie, W. G., McElroy, W. D. The Spectral Distribution of Firefly Light. J. Gen. Physiol. 48, 95-104 (1964).
- Shorter, J. The mammalian disaggregase machinery: Hsp110 synergizes with Hsp70 and Hsp40 to catalyze protein disaggregation and reactivation in a cell-free system. PLoS One. 6, e26319 (2011).
- Tkach, J. M., Glover, J. R. Nucleocytoplasmic trafficking of the molecular chaperone Hsp104 in unstressed and heat-shocked cells. Traffic. 9, 39-56 (2008).
- Unno, K., Kishido, T., Hosaka, M., Okada, S. Role of Hsp70 subfamily, Ssa, in protein folding in yeast cells, seen in luciferase-transformed ssa mutants. Biol. Pharm. Bull. 20, 1240-1244 (1997).
- Verghese, J., Abrams, J., Wang, Y., Morano, K. A. Biology of the heat shock response and protein chaperones: budding yeast (Saccharomyces cerevisiae) as a model system. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 76, 115-158 (2012).
