Los ensayos acoplados para Monitoreo replegamiento de proteínas en<em> Saccharomyces cerevisiae</em
Summary
Este artículo describe el uso de una proteína de fusión luciferasa de luciérnaga-GFP para investigar<em> In vivo</em> Plegamiento de proteínas en<em> Saccharomyces cerevisiae</em>. El uso de este reactivo, el replegamiento de un modelo de proteína desnaturalizada con calor puede ser controlada simultáneamente por microscopía de fluorescencia y un ensayo enzimático para investigar las funciones de los componentes de la red Proteostasis en el control de calidad de la proteína.
Abstract
Proteostasis, definida como los procesos combinados de plegamiento de proteínas / biogénesis, replegado / reparación, y la degradación, es un delicado equilibrio celular que se debe mantener para evitar consecuencias perjudiciales 1. Factores externos o internos que perturban este equilibrio puede conducir a la agregación de la proteína, la toxicidad y la muerte celular. En los seres humanos esto es un factor importante que contribuye a los síntomas asociados con los trastornos neurodegenerativos tales como la enfermedad de Huntington, Parkinson, y las enfermedades de Alzheimer 10. Por lo tanto, es esencial que las proteínas implicadas en el mantenimiento de proteostasis ser identificados con el fin de desarrollar los tratamientos para estas enfermedades debilitantes. Este artículo describe las técnicas para el seguimiento en el plegamiento de proteínas in vivo a una resolución de tiempo casi real utilizando el modelo de proteína luciferasa de luciérnaga fusionado a la proteína fluorescente verde (FFL-GFP). FFL-GFP es una proteína quimérica modelo único como resto de FFL es extremadamente sensible a la tensión inducida por misfolding y la agregación, que inactiva la enzima 12. La actividad de luciferasa se controló usando un ensayo enzimático, y el resto de GFP proporciona un método de visualización de FFL soluble o agregada mediante microscopía automatizada. Estos métodos acoplados incorporan dos enfoques paralelos y técnicamente independiente para analizar tanto replegamiento y la reactivación funcional de una enzima después de estrés. Recuperación de la actividad se puede correlacionar directamente con la cinética de desagregación y de re-solubilización para comprender mejor cómo los factores de control de calidad de proteínas, tales como chaperones de la proteína colaboran para llevar a cabo estas funciones. Además, las supresiones de genes o mutaciones se pueden usar para probar las contribuciones de proteínas específicas o subunidades de proteínas a este proceso. En este artículo se reflexiona sobre las aportaciones de la proteína disaggregase Hsp104 13, conocido por colaborar con el factor de cambio Hsp40/70/nucleotide (NEF) Sistema 5 replegado, con el replegamiento de proteínas para validar este enfoque.
Introduction
En los seres humanos trastornos neurodegenerativos incluyendo la enfermedad de Alzheimer, Parkinson, y las enfermedades de Huntington se han relacionado con el mal plegamiento y la agregación de la proteína 10. Las células emplean chaperones moleculares para prevenir atrapamiento cinética de las proteínas celulares en las estructuras inactivas mal plegadas 6. Los acompañantes que participen en redes de interacción complejas dentro de la célula, pero no se conocen con exactitud cómo la suma de estas interacciones contribuye a proteostasis organismo. Uno de los principales chaperonas responsables de la mayoría de plegamiento de la proteína citosólica es la proteína de choque térmico de 70 kDa (Hsp70) de la familia 19. Se ha demostrado que en la pérdida de la levadura de Hsp70 disminuye la capacidad de doblar naciente de FFL heteróloga expresada y para replegar la proteína endógena, ornitina transcarbamilasa, in vivo 18, 7. La capacidad de analizar plegable con resolución de tiempo casi real, facilitará la comprensión de cómo los factores celulares cont adicionalribute a este proceso de Hsp70-dependiente. Además, plegado / replegamiento reacciones no puede ser completamente dependiente de estas proteínas que contribuyen, por lo que los ensayos deben ser lo suficientemente sensible como para detectar tanto los cambios grandes y pequeños en la cinética y la eficiencia.
El disaggregase célula de levadura, Hsp104, juega un papel vital en la reparación de las proteínas mal plegadas agregados. Aunque Hsp104 homólogos han sido identificados en hongos y plantas, esta familia parece estar ausente en metazoos. Se ha propuesto que otras chaperonas tales como los de la familia Hsp110 realizan algunos de los conocidos Hsp104 actividades en mamíferos 16. Hsp104 es un +, complejo de proteínas hexameric AAA que funciona en la levadura de proteínas remodelación de agregados, que contribuyen a replegado y reparación 13. Hsp104, junto con la levadura Hsp70, ssa1, y la levadura Hsp40, Ydj1, se requiere para la recuperación de FLE desnaturalizado en células de levadura 5, 8. La pequeña proteína de choque térmico, Hsp26, también se ha demostrado que es Requirojo para la desagregación Hsp104 mediada OFF 2.
FFL, es una proteína de dos dominios que se une el sustrato luciferina en el sitio activo y después de un cambio conformacional que requiere ATP y el oxígeno, descarboxila el sustrato liberando oxiluciferina, dióxido de carbono (CO 2), monofosfato de adenosina (AMP), y la luz 11, 9, 3. El sustrato disponible comercialmente FFL, D-luciferina, resulta en la emisión de luz entre 550-570 nm que pueden ser detectados usando un luminómetro 15. FLE es exquisitamente sensible a la desnaturalización de los tratamientos químicos o calor y agregados rápidamente al despliegue. Cuando se expone a temperaturas entre 39-45 ° C OFF se desarrolló reversible e inactivadas 12. Por el contrario, GFP y sus derivados son altamente resistentes a desplegamiento de la proteína tensiones 14. Por lo tanto, la fusión de estas dos proteínas permite OFF para funcionar como un resto experimentalmente lábil capaz de dirigirse funcional TFP a intracelular de depósitos que se pueden visualizar mediante microscopía de fluorescencia a la población y de los niveles de células individuales. Aplicación del ensayo enzimático en un lector de placas multimodo semi-automatizado junto con microscopía automatizada permite la evaluación simultánea sin precedentes de la cinética y el rendimiento de replegamiento reacciones. Además, la genética molecular fáciles del modelo eucariota Saccharomyces cerevisiae permite tanto la manipulación precisa de la red de control de calidad de la proteína y la oportunidad para que los enfoques basados en descubrimientos para identificar nuevos jugadores que contribuyen a la respuesta al estrés celular y proteostasis.
En este estudio, las cepas de tipo salvaje (WT) y HSP104 eliminación expresan FFL-GFP están sujetos a la desnaturalización de proteínas de choque térmico. FFL-GFP replegamiento se controla a través tanto de un ensayo enzimático y microscopía como una lectura de proxy para la reparación del proteoma expresado sobre un curso de tiempo de recuperación. En comparación con las células WT, mostramos ªsupresión cepa e Hsp104 es de ~ 60% menos eficientes en el replegamiento FFL-GFP, el apoyo a los hallazgos previos establecen un rol para Hsp104 en la reactivación de desnaturalizado OFF 2.
Protocol
Representative Results
Discussion
En este artículo la proteína modelo FFL-GFP se utilizó para demostrar que el disaggregase levadura, Hsp104 contribuye a la proteína re-solubilización y reparación. Los ensayos enzimáticos y microscopía interrogados diferencialmente el estado de la misma proteína sustrato para determinar la eficiencia y el rendimiento de replegamiento. Resultados de los ensayos de recuperación enzimáticos sugieren que no sólo es la recuperación máxima en la cepa mutante hsp104D ineficiente, pero la magnitud inicial…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por una beca de los Institutos Nacionales de Salud (NIGMS-074696) a KAM y la Sociedad Americana de Microbiología Robert D. Watkins de Becas de Postgrado Investigación Estudiantil de JLA También agradecemos a John Glover en la Universidad de Toronto para la prestación del FLE -GFP fuente de plásmido.
Materials
| Reagents | |||
| Synergy MX Microplate Reader | BioTek | ||
| Olympus IX81-ZDC Confocal Inverted Microscope | Olympus, Tokyo Japan | ||
| Lumitrac 200 white 96-well plates | USA Scientific | ||
| SlideBook 5.0 digital microscopy software | Intelligent Imaging Innovations, Inc. Denver, CO, USA | ||
| Equipment | |||
| Tris Base | Fisher | BP152-1 | |
| (LiAc) Lithium Acetate | Sigma | L6883 | |
| PEG (polyethelene glycol) | Fisher | BP233-1 | |
| EDTA | Fisher | BP120-1 | |
| DMSO | Malinckrodt | 4948 | |
| SC | Sunrise | 1300-030 | |
| SC-URA | Sunrise | 1306-030 | |
| cycloheximide | Acros Organics | 357420050 | |
| D-luciferin | Sigma | L9504 | |
| low melt agarose | NuSieve | 50082 | |
| immersion oil | Cargille | 16484 |
References
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