Kopplade Analyser för övervakning Proteinåterveckningssteg i<em> Saccharomyces cerevisiae</em
Summary
Denna artikel beskriver användningen av en eldflugeluciferas-GFP fusionsprotein för att undersöka<em> In vivo</em> Proteinvikning<em> Saccharomyces cerevisiae</em>. Med hjälp av detta reagens, omvikning av en modell värmedenaturerad protein kan övervakas samtidigt genom fluorescens mikroskopi och en enzymatisk analys för att undersöka de roller komponenterna proteostasis nätverk i protein kvalitetskontroll.
Abstract
Proteostasis, definieras som de kombinerade processerna protein folding / biogenes är omveckning / reparation, och förnedring, en delikat cellulär balans som måste upprätthållas för att undvika skadliga konsekvenser 1. Yttre eller inre faktorer som stör denna balans kan leda till proteinaggregation, toxicitet och celldöd. Hos människor är detta en stor bidragande faktor till de symptom i samband med neurodegenerativa sjukdomar såsom Huntingtons, Parkinsons och Alzheimers sjukdomar 10. Det är därför väsentligt att de proteiner som är involverade i upprätthållande av proteostasis identifieras för att utveckla behandlingar för dessa försvagande sjukdomar. I artikeln beskrivs tekniker för övervakning in vivo protein folding vid nära-realtid upplösning med hjälp av modellen protein eldflugeluciferas smält till grönt fluorescerande protein (FFL-GFP). FFL-GFP är en unik modell chimär protein som FFL delen är extremt känslig för stress-induced misfolding och aggregering, som inaktiverar enzymet 12. Luciferasaktivitet övervakas med användning av en enzymatisk analys, och GFP-delen tillhandahåller en metod för att visualisera lösliga eller aggregerade FFL använder automatiserad mikroskopering. Dessa kopplade metoder innehåller två parallella och tekniskt oberoende metoder för att analysera både tillbakaveckning och funktionell återaktivering av ett enzym efter stress. Aktivitet återhämtning kan direkt korrelerad med kinetik disaggregation och re-solubilisering att bättre förstå hur protein kvalitetskontroll faktorer såsom protein följeslagare samarbetar för att utföra dessa funktioner. Dessutom kan gendeletioner eller mutationer användas för att testa bidrag av specifika proteiner eller subenheter protein till denna process. I denna artikel kommer vi att granska inläggen av proteinet disaggregase Hsp104 13, känd för att samarbeta med den Hsp40/70/nucleotide utbyte faktor (NEF) omveckning systemet 5, till Proteinåterveckningssteg att validera denna metod.
Introduction
Hos människor neurodegenerativa sjukdomar, inklusive Alzheimers, Parkinsons och Huntingtons sjukdomar har kopplats till proteiners ansamling och aggregering 10. Celler använder molekylära följeslagare att förhindra kinetisk fångst av cellulära proteiner i felveckade inaktiva strukturer 6. Chaperoner deltar i intrikata samspel nätverk inom cellen, men det är inte helt klarlagt hur summan av dessa interaktioner bidrar till organismal proteostasis. En av de viktigaste följeslagare som ansvarar för majoriteten av cytosolproteinet vikning är 70 kD värmechockproteinet (Hsp70) familj 19. Det har visats att i jäst förlust av Hsp70 minskar förmågan att vika nascent heterologt uttryckt FFL och att återvecka det endogena proteinet, ornitin transcarbamoylase, in vivo 18, 7. Förmågan att analysera vikning med nära-realtid upplösning kommer att underlätta förståelsen hur ytterligare cellulära faktorer fortsribute till denna Hsp70-beroende process. Dessutom kan vika / återvikning reaktioner inte vara helt beroende av dessa bidragande proteiner, så analyser måste vara tillräckligt känsliga för att upptäcka både stora och små förändringar i kinetik och effektivitet.
Jästcellen disaggregase, Hsp104, spelar en viktig roll för att reparera aggregerade felveckade proteiner. Även Hsp104 homologer har identifierats i svampar och växter, verkar denna familj att vara frånvarande i metazoans. Det har föreslagits att andra följeslagare, såsom de i Hsp110 familjen utföra en del av de kända Hsp104 aktiviteter i däggdjur 16. Hsp104 är en AAA +, hexamert protein komplex som fungerar i jäst till aggregat omforma protein, som bidrar till omveckning och reparation 13. Hsp104, tillsammans med jästen Hsp70, Ssa1, och jästen Hsp40, Ydj1, krävs för återvinning av denaturerat FFL i jästceller 5, 8. Den lilla värmechockprotein, Hsp26, har också visat sig vara requirött för Hsp104-medierad indelning av FFL 2.
FFL är en två-domän protein som binder substratet luciferin i det aktiva sätet och efter en strukturförändring som kräver ATP och syre, dekarboxylerar substratet släppa oxyluciferin, koldioxid (CO 2), adenosinmonofosfat (AMP), och ljus 11, 9, 3. Den kommersiellt tillgängliga FFL substrat, D-luciferin, resulterar i ljusemission mellan 550-570 nm som kan detekteras med hjälp av en luminometer 15. FFL är extremt känsligt för denaturering från kemiska eller värmebehandlingar och aggregat snabbt vid utspelas. När de utsätts för temperaturer mellan 39-45 ° C FFL är reversibelt utfälld och inaktiverat 12. Däremot GFP och dess derivat är mycket motståndskraftiga mot protein utspelas påkänningar 14. Därför sammansmältning av dessa två proteiner tillåter FFL att fungera som en experimentellt labil del med förmåga att rikta funktionell GFP till intracellulära avlagringar som kan visualiseras med hjälp av fluorescens mikroskopi hos både befolkningen och enskilda nivåerna cell. Tillämpning av enzymatisk analys i en semi-automatiserad multimode plattläsare kombination med automatiserad mikroskopering ger oöverträffad samtidig bedömning av kinetik och avkastning av återveckning reaktioner. Dessutom tillåter den enkla molekylära genetiken av modellen eukaryoten Saccharomyces cerevisiae både exakt manipulering av proteinet kvalitetskontroll nätverk och möjlighet till upptäckt-baserade metoder för att identifiera nya spelare som bidrar till cellulär stress och proteostasis.
I denna studie, vildtyp (WT) och Hsp104 deletion stammar som uttrycker FFL-GFP är föremål för protein denaturering värmechock. FFL-GFP refolding följs upp genom både en enzymatisk analys och mikroskopi som en proxy avläsning för reparation av det uttryckta proteomet över en återhämtning tidsförlopp. Vid jämförelse med WT-celler, visar vi the Hsp104 radering stam är ~ 60% mindre effektiva på återveckning FFL-GFP, stöder tidigare fynd om inrättande av en roll för Hsp104 i reaktivering av denaturerat FFL 2.
Protocol
Representative Results
Discussion
I den här artikeln modellen protein FFL-GFP användes för att visa att jästen disaggregase, bidrar Hsp104 till protein re-upplösning och reparation. De enzymatiska analyser och mikroskopi utfrågas differentiellt status för samma substrat-proteinet för att bestämma återveckning effektivitet och utbyte. Resultat av de enzymatiska återhämtning analyserna tyder på att inte bara är den maximala återhämtningen i hsp104D mutantstammen ineffektiv, men den initiala storleken hos den pågående spänningen…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av ett bidrag från National Institutes of Health (NIGMS-074.696) till KAM och en American Society of Microbiology Robert D. Watkins Graduate Student Research Fellowship till JLA Vi tackar också John Glover vid universitetet i Toronto för att tillhandahålla FFL -GFP källa plasmid.
Materials
| Reagents | |||
| Synergy MX Microplate Reader | BioTek | ||
| Olympus IX81-ZDC Confocal Inverted Microscope | Olympus, Tokyo Japan | ||
| Lumitrac 200 white 96-well plates | USA Scientific | ||
| SlideBook 5.0 digital microscopy software | Intelligent Imaging Innovations, Inc. Denver, CO, USA | ||
| Equipment | |||
| Tris Base | Fisher | BP152-1 | |
| (LiAc) Lithium Acetate | Sigma | L6883 | |
| PEG (polyethelene glycol) | Fisher | BP233-1 | |
| EDTA | Fisher | BP120-1 | |
| DMSO | Malinckrodt | 4948 | |
| SC | Sunrise | 1300-030 | |
| SC-URA | Sunrise | 1306-030 | |
| cycloheximide | Acros Organics | 357420050 | |
| D-luciferin | Sigma | L9504 | |
| low melt agarose | NuSieve | 50082 | |
| immersion oil | Cargille | 16484 |
References
- Balch, W. E., Morimoto, R. I., Dillin, A., Kelly, J. W. Adapting proteostasis for disease intervention. Science. 319, 916-919 (2008).
- Cashikar, A. G., Duennwald, M., Lindquist, S. L. A chaperone pathway in protein disaggregation. Hsp26 alters the nature of protein aggregates to facilitate reactivation by Hsp104. J. Biol. Chem. 280, 23869-23875 (2005).
- Conti, E., Lloyd, L. F., Akins, J., Franks, N. P., Brick, P. Crystallization and preliminary diffraction studies of firefly luciferase from Photinus pyralis. Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 52, 876-878 (1996).
- Gietz, R. D., Schiestl, R. H., Willems, A. R., Woods, R. A. Studies on the transformation of intact yeast cells by the LiAc/SS-DNA/PEG procedure. Yeast. 11, 355-360 (1995).
- Glover, J. R., Lindquist, S. Hsp104, Hsp70, and Hsp40: a novel chaperone system that rescues previously aggregated proteins. Cell. 94, 73-82 (1998).
- Grantcharova, V., Alm, E. J., Baker, D., Horwich, A. L. Mechanisms of protein folding. Curr. Opin. Struct. Biol. 11, 70-82 (2001).
- Kim, S., Schilke, B., Craig, E. A., Horwich, A. L. Folding in vivo of a newly translated yeast cytosolic enzyme is mediated by the SSA class of cytosolic yeast Hsp70 proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 12860-12865 (1998).
- Lum, R., Niggemann, M., Glover, J. R. Peptide and protein binding in the axial channel of Hsp104. Insights into the mechanism of protein unfolding. J. Biol. Chem. 283, 30139-30150 (2008).
- Marques, S. M., Esteves da Silva, J. C. Firefly bioluminescence: a mechanistic approach of luciferase catalyzed reactions. IUBMB Life. 61, 6-17 (2009).
- Morimoto, R. I. The heat shock response: systems biology of proteotoxic stress in aging and disease. Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 76, 91-99 (2011).
- Nakatsu, T., et al. Structural basis for the spectral difference in luciferase bioluminescence. Nature. 440, 372-376 (2006).
- Nathan, D. F., Vos, M. H., Lindquist, S. In vivo functions of the Saccharomyces cerevisiae Hsp90 chaperone. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 12949-12956 (1997).
- Parsell, D. A., Kowal, A. S., Singer, M. A., Lindquist, S. Protein disaggregation mediated by heat-shock protein Hsp104. Nature. 372, 475-478 (1994).
- Penna, T. C., Ishii, M., Junior, A. P., Cholewa, O. Thermal stability of recombinant green fluorescent protein (GFPuv) at various pH values. Appl. Biochem. Biotechnol. , 113-116 (2004).
- Seliger, H. H., Buck, J. B., Fastie, W. G., McElroy, W. D. The Spectral Distribution of Firefly Light. J. Gen. Physiol. 48, 95-104 (1964).
- Shorter, J. The mammalian disaggregase machinery: Hsp110 synergizes with Hsp70 and Hsp40 to catalyze protein disaggregation and reactivation in a cell-free system. PLoS One. 6, e26319 (2011).
- Tkach, J. M., Glover, J. R. Nucleocytoplasmic trafficking of the molecular chaperone Hsp104 in unstressed and heat-shocked cells. Traffic. 9, 39-56 (2008).
- Unno, K., Kishido, T., Hosaka, M., Okada, S. Role of Hsp70 subfamily, Ssa, in protein folding in yeast cells, seen in luciferase-transformed ssa mutants. Biol. Pharm. Bull. 20, 1240-1244 (1997).
- Verghese, J., Abrams, J., Wang, Y., Morano, K. A. Biology of the heat shock response and protein chaperones: budding yeast (Saccharomyces cerevisiae) as a model system. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 76, 115-158 (2012).
