La ricostituzione di un canale Kv in membrane lipidiche per gli studi strutturali e funzionali
Summary
Procedure per la ricostituzione completa di un canale del potassio voltaggio-dipendenti prototipo nelle membrane lipidiche sono descritti. I canali ricostituiti sono adatti per saggi biochimici, registrazioni elettriche, screening ligando e studi cristallografici di elettroni. Questi metodi possono avere applicazioni generali agli studi strutturali e funzionali di altre proteine di membrana.
Abstract
Studiare l'interazione proteina-lipide in modo riduttivo, è necessario incorporare le proteine di membrana nelle membrane di composizione lipidica ben definita. Stiamo studiando gli effetti di gating lipidi-dipendenti in un potassio voltaggio-dipendenti (Kv) canale di prototipo, e abbiamo lavorato procedure dettagliate per ricostituire i canali in diversi sistemi a membrana. Nostre procedure ricostituzione tengono conto sia della fusione detergente indotta di vescicole e la fusione di proteina / detergente micelle con i lipidi / detergente micelle miste nonché l'importanza di raggiungere una distribuzione di equilibrio di lipidi tra le proteine / detergente / lipidi e il detersivo / lipidi micelle miste. I nostri dati suggeriscono che l'inserimento di canali nei vescicole lipidiche è relativamente casuale in orientamenti, e l'efficienza di ricostituzione è così alto che non rilevabili aggregati proteici sono stati osservati in esperimenti di frazionamento. Abbiamo utilizzato il ricostituired canali per determinare gli stati conformazionali dei canali in differenti lipidi, registrare attività elettrica di un piccolo numero di canali incorporate in bistrati lipidici planari, schermo per ligandi conformazione-specifici da una libreria peptidica fago visualizzato, e sostenere la crescita dei cristalli 2D dei canali in membrane. Le procedure descritte qui di ricostituzione possono essere adeguati per lo studio di altre proteine di membrana in doppi strati lipidici, in particolare per l'indagine degli effetti dei lipidi sui canali ionici voltaggio-dipendenti eucariotiche.
Introduction
Celle scambiare materiali e informazioni con l'ambiente attraverso le funzioni delle proteine di membrana specifici 1. Le proteine di membrana nelle membrane cellulari funzionano come pompe, canali, recettori, enzimi intramembrane, linker e sostenitori strutturali attraverso le membrane. Le mutazioni che influenzano le proteine di membrana sono stati legati a molte malattie umane. Infatti, molte proteine di membrana sono stati gli obiettivi farmacologici primari perché sono importanti e facilmente accessibili nelle membrane cellulari. È quindi molto importante per comprendere la struttura e funzione di varie proteine di membrana nelle membrane, e consentire di escogitare nuovi metodi per alleviare gli effetti negativi delle proteine mutanti in malattie umane.
Lipidi circondano tutte le proteine di membrana integrati in doppi strati 2, 3. In membrane eucariotiche, i vari tipi di lipidi sono noti come organizzato in microdomini 4, 5.Molte proteine di membrana sono stati mostrati essere distribuite tra questi microdomini nonché la fase fluida ingombrante di membrane 3, 6. Il meccanismo alla base l'organizzazione dei microdomini e la consegna di proteine di membrana in loro e il significato fisiologico di tali distribuzioni sono chiaramente importanti, ma rimangono poco conosciute. Una delle principali difficoltà tecnica a studiare gli effetti dei lipidi sulle proteine di membrana è la ricostituzione affidabile di biochimicamente purificata proteine di membrana nelle membrane di composizione lipidica ben controllati in modo che quasi tutte le proteine ricostituite sono funzionali 7. Negli ultimi anni, abbiamo sviluppato metodi per ricostituire il prototipo di canale del potassio voltaggio-dipendente da A. Pernix (KvAP) nei vari sistemi a membrana per gli studi 8-10 strutturali e funzionali. I dati da altri e noi insieme hanno mostrato che i lipidi sono probabili un determinante nei cambiamenti conformazionali del rilevamento della tensionedomini di un canale e ionici voltaggio-dipendenti possono modellare le strutture di alcuni di questi canali 11. Nel prossimo, ci fornirà una descrizione dettagliata dei nostri metodi e offrirà suggerimenti tecnici critici che probabilmente garantire il successo riproduttivo dei nostri risultati, nonché l'estensione dei nostri metodi per gli studi di altre proteine di membrana.
Protocol
Representative Results
Discussion
La ricostituzione dei canali KvAP in diverse membrane è stata utilizzata in diversi studi 8-10. Seguendo l'idea di garantire la distribuzione dei lipidi tra detergenti / lipide micelle miste e le proteine / detergente / lipide micelle miste, siamo in grado di raggiungere quasi completa ricostituzione del KvAP nelle membrane in molto differenti lipidi. Ogni canale KvAP tetramerica bisogno ~ 100 molecole lipidiche per coprire pienamente il suo dominio transmembrana. Il requisito essenziale è permett…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli studi sulla KvAP nel Jiang laboratorio hanno ottenuto un aiuto significativo dal laboratorio del Dr. Roderick MacKinnon presso la Rockefeller University. Un ringraziamento particolare va al Dott. Kathlynn Brown e Michael McQuire per i loro consigli e aiuto sui nostri esperimenti fago schermo. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dal NIH (GM088745 e GM093271 a Q-XJ) e AHA (12IRG9400019 a Q-XJ).
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Tryptone | RPI Corp. | T60060 | |
| Yeast Extract | RPI Corp. | Y20020 | |
| NaCl | Fisher | S271-3 | |
| Tris Base | RPI Corp. | T60040 | |
| Potassium Chloride | Fisher | BP366-500 | |
| n-Dodecyl-β-D-Maltoside | Affymetrix | D322S | Sol-grade |
| n-Octyl-β-D-Glucoside | Affymetrix | O311 | Ana-grade |
| Aprotinin | RPI Corp. | A20550-0.05 | |
| Leupeptin | RPI Corp. | L22035-0.025 | |
| Pepstatin A | RPI Corp. | P30100-0.025 | |
| PMSF | SIGMA | P7626 | |
| Dnase I | Roche | 13407000 | |
| Bio-Bead SM-2 | Bio-Rad | 152-3920 | |
| HEPES | RPI Corp. | H75030 | |
| POPE | Avanti Polar Lipids | 850757C | |
| POPG | Avanti Polar Lipids | 840457C | |
| DOGS | Avanti Polar Lipids | 870314C | |
| DMPC | Avanti Polar Lipids | 850345C | |
| Biotin-DOPE | Avanti Polar Lipids | 870282C | |
| DOTAP | Avanti Polar Lipids | 890890C | |
| NeutrAvidin agarose beads | Piercenet | 29200 | |
| Dialysis Tubing | Spectrum Laboratories, Inc | 132-570 | |
| Pentane | Fisher | R399-1 | |
| Decane | TCI America | D0011 | |
| MTS-PEG5000 | Toronto Research Cemicals | M266501 |
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