Yapısal ve İşlevsel Araştırmalar için Lipid Membranlar bir Kv Kanal Sulandırma
Summary
Lipid membranlar bir prototip voltaj kapılı potasyum kanalı tam sulandırılması için prosedürler açıklanmıştır. Sulandırılmış kanallar biyokimyasal testler, elektrik kayıtları, ligand ve tarama elektron kristalografik çalışmalar için uygundur. Bu yöntemler, başka zar proteinlerinin yapısal ve fonksiyonel çalışmalar için genel uygulamalar olabilir.
Abstract
Indirgeyici bir şekilde lipid protein etkileşimi araştırmak için, iyi tanımlanmış bir lipid kompozisyonu membran içine membran proteinleri de dahil için gereklidir. Biz bir prototip voltaj bağımlı potasyum (Kv) kanalında lipid bağlı yolluk etkilerini araştırıyor ve farklı membran sistemlerine sulandırmak kanallarına detaylı işlemleri çalıştım. Bizim sulandırma prosedürler deterjan indüklenen veziküllerin füzyon proteini ve / deterjan lipid / deterjan karışık miseller ile miseller gibi protein / deterjan / lipid ve deterjan arasında lipitlerin bir denge dağılımı ulaşma önemi füzyon hem de dikkate almak / lipid karışık miseller. Bizim veri lipid veziküller içinde kanallarının ekleme yönelimleri nispeten rastgele önerdi ve sulandırma verimliliği saptanabilir protein agrega fraksiyon deneylerde görüldü o kadar yüksektir. Biz sulandırmak kullanmış olmasıFarklı lipid kanalların yapısal durumları belirlemek için d kanalları, düzlemsel çift katlı lipit katmanını dahil kanalları az sayıda, bir faj görüntülenir peptid kütüphane uyum özgü ligandlar için ekranın elektrik faaliyetleri kayıt ve 2D kristallerin büyümesini desteklemek zarlarında kanalları. Burada anlatılan sulandırılması prosedürleri, özellikle ökaryotik voltaj kapılı iyon kanalları lipid etkilerinin araştırılması için, lipid tabakalarıdır Diğer zar proteinleri çalışmak için adapte edilebilir.
Introduction
Hücreler Döviz malzemeler ve spesifik membran proteinlerin 1 fonksiyonları yoluyla çevre ile bilgiler. Hücre zarlarında membran proteinlerinin pompalar, kanallar, reseptörler, intramembrane enzimler, bağlayıcı ve membranlar arasında yapısal destekçileri olarak işlev. Membran proteinleri etkileyen mutasyonların birçok insan hastalıkları ile ilgili olmuştur. Bu önemli ve hücre zarlarında kolayca erişilebilir olduğu için Aslında, birçok membran protein birincil ilaç hedefleri olmuştur. Bu membranlar çeşitli membran proteinlerinin yapısı ve işlevini anlamak ve mümkün insan hastalıklarda mutant proteinlerden zararlı etkileri hafifletmek için yeni yöntemler bulmak için yapmak bu nedenle çok önemlidir.
Lipidler bilayers 2, 3 entegre tüm membran proteinleri çevreleyen. Ökaryotik membranlar, lipidlerin çeşitli farklı türleri microdomains 4, 5 halinde organize edilebilir olduğu bilinmektedir.Birçok zar proteinleri, bu microdomains yanı sıra membran 3, 6, hacimli sıvı faz olarak dağıtılmak üzere gösterilmiştir. Microdomains ve membran proteinlerinin teslim onlara ve bu dağılımlar fizyolojik önemi organizasyonu altında yatan mekanizma açıkça önemlidir ama tam olarak anlaşılamamıştır kalır. Membran proteinleri üzerinde lipid etkileri okuyan bir önemli teknik zorluk hemen hemen tüm yeniden proteinlerin fonksiyonel 7 böylece biyokimyasal iyi kontrollü lipid kompozisyon membranlar içine membran proteinlerinin saflaştırılmış güvenilir sulandırma olduğunu. Son birkaç yıl içinde, biz sulandırmak için A. prototip voltaj bağımlı potasyum kanal yöntemleri geliştirdi yapısal ve fonksiyonel çalışmalar için çeşitli 8-10 membran sistemleri içine pernix (KvAP). Diğerlerinden verileri ve hep birlikte lipid muhtemel voltaj algılama konformasyonel değişiklikler belirleyici olduğunu gösterdiBir voltaj kapılı bir iyon kanalı ve etki bu kanallar 11 bazı yapıları şekli olabilir. Bir sonraki, bizim yöntemleri ayrıntılı bir açıklama sağlayacak ve büyük olasılıkla bizim sonuçlarının başarılı üreme ve diğer membran proteinlerinin çalışmalara bizim yöntemlerin uzantısı sağlayacak kritik teknik ipuçları sunacak.
Protocol
Representative Results
Discussion
Farklı membranlar içine KvAP kanalları sulandırma çeşitli çalışmalar 8-10 kullanılmıştır. Deterjan / lipid karışık miselleri ve protein / deterjan / lipid karışık misel arasında lipid dağılımı sağlanması fikri ardından, çok farklı lipid yapılmış membranlar içine KvAP yaklaşık tam sulandırma ulaşabiliyorlar. Her tetramerik KvAP kanalı tam olarak transmembran alanı kapsayacak şekilde ~ 100 lipid molekülleri ihtiyacı var. Temel gereksinim deterjan kaldırılmadan önce y…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Jiang laboratuarında KvAP üzerinde çalışmalar Rockefeller Üniversitesi Dr Roderick MacKinnon en laboratuvarından önemli yardım almış. Özel teşekkür onların tavsiyelerini Dr Kathlynn Brown ve Michael McQuire gidip bizim faj ekran deneylere yardımcı olur. Bu çalışma NIH (Q-XJ için GM088745 ve GM093271) ve AHA (Q-XJ için 12IRG9400019) hibe tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Tryptone | RPI Corp. | T60060 | |
| Yeast Extract | RPI Corp. | Y20020 | |
| NaCl | Fisher | S271-3 | |
| Tris Base | RPI Corp. | T60040 | |
| Potassium Chloride | Fisher | BP366-500 | |
| n-Dodecyl-β-D-Maltoside | Affymetrix | D322S | Sol-grade |
| n-Octyl-β-D-Glucoside | Affymetrix | O311 | Ana-grade |
| Aprotinin | RPI Corp. | A20550-0.05 | |
| Leupeptin | RPI Corp. | L22035-0.025 | |
| Pepstatin A | RPI Corp. | P30100-0.025 | |
| PMSF | SIGMA | P7626 | |
| Dnase I | Roche | 13407000 | |
| Bio-Bead SM-2 | Bio-Rad | 152-3920 | |
| HEPES | RPI Corp. | H75030 | |
| POPE | Avanti Polar Lipids | 850757C | |
| POPG | Avanti Polar Lipids | 840457C | |
| DOGS | Avanti Polar Lipids | 870314C | |
| DMPC | Avanti Polar Lipids | 850345C | |
| Biotin-DOPE | Avanti Polar Lipids | 870282C | |
| DOTAP | Avanti Polar Lipids | 890890C | |
| NeutrAvidin agarose beads | Piercenet | 29200 | |
| Dialysis Tubing | Spectrum Laboratories, Inc | 132-570 | |
| Pentane | Fisher | R399-1 | |
| Decane | TCI America | D0011 | |
| MTS-PEG5000 | Toronto Research Cemicals | M266501 |
References
- Alberts, B., et al. . Molecular Biology of the Cell. , (2007).
- Lee, A. G. How lipids and proteins interact in a membrane: a molecular approach. Mol. Biosyst. 1, 203 (2005).
- Lee, A. G. How lipids affect the activities of integral membrane proteins. Biochim. Biophys. Acta. 1666, 62 (2004).
- Anderson, R. G. The caveolae membrane system. Annu. Rev. Biochem. 67, 199 (1998).
- Simons, K., Vaz, W. L. Model systems, lipid rafts, and cell membranes. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 33, 269 (2004).
- Edidin, M. The state of lipid rafts: from model membranes to cells. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 32, 257 (2003).
- Kapoor, R., Kim, J. H., Ingolfson, H., Andersen, O. S. Preparation of Artificial Bilayers for Electrophysiology Experiments. J. Vis. Exp. (20), e1033 (2008).
- Zheng, H., Liu, W., Anderson, L. Y., Jiang, Q. X. Lipid-dependent gating of a voltage-gated potassium channel. Nat. Commun. 2, 250 (2011).
- Schmidt, D., Jiang, Q. X., MacKinnon, R. Phospholipids and the origin of cationic gating charges in voltage sensors. Nature. 444, 775 (2006).
- Ruta, V., Jiang, Y., Lee, A., Chen, J., MacKinnon, R. Functional analysis of an archaebacterial voltage-dependent K+ channel. Nature. 422, 180 (2003).
- Jiang, Q. X., Gonen, T. The influence of lipids on voltage-gated ion channels. Curr. Opin. Struct. Biol. , 3408884 (2012).
- Artimo, P., et al. ExPASy: SIB bioinformatics resource portal. Nucleic Acids Res. 40, W597 (2012).
- Cladera, J., Rigaud, J. L., Villaverde, J., Dunach, M. Liposome solubilization and membrane protein reconstitution using Chaps and Chapso. Eur. J. Biochem. 243, 798 (1997).
- Levy, D., Bluzat, A., Seigneuret, M., Rigaud, J. L. A systematic study of liposome and proteoliposome reconstitution involving Bio-Bead-mediated Triton X-100 removal. Biochim. Biophys. Acta. 1025, 179 (1990).
- Young, H. S., Rigaud, J. L., Lacapere, J. J., Reddy, L. G., Stokes, D. L. How to make tubular crystals by reconstitution of detergent-solubilized Ca2(+)-ATPase. Biophys. J. 72, 2545 (1997).
- Levy, D., Gulik, A., Bluzat, A., Rigaud, J. L. Reconstitution of the sarcoplasmic reticulum Ca(2+)-ATPase: mechanisms of membrane protein insertion into liposomes during reconstitution procedures involving the use of detergents. Biochim. Biophys. Acta. 1107, 283 (1992).
- Cohen, F. S., Zimmerberg, J., Finkelstein, A. Fusion of phospholipid vesicles with planar phospholipid bilayer membranes. II. Incorporation of a vesicular membrane marker into the planar membrane. The Journal of General Physiology. 75, 251 (1980).
- Fuks, B., Homble, F. Permeability and electrical properties of planar lipid membranes from thylakoid lipids. Biophysical Journal. 66, 1404 (1994).
- Hanke, W., Schlue, W. -. R., Sattelle, D. B. Planar Lipid Bilayers. Methods and Applications. Biological Techniques. , 133 (1993).
- Tien, H. T. . Bilayer lipid membranes (BLM). Theory and Practice. , 655-65 (1974).
- Pagano, R. E., Ruysschaert, J. M., Miller, I. R. The molecular composition of some lipid bilayer membranes in aqueous solution. The Journal of Membrane Biology. 10, 11 (1972).
- Henn, F. A., Thompson, T. E. Properties of lipid bilayer membranes separating two aqueous phases: composition studies. Journal of Molecular Biology. 31, 227 (1968).
- Tao, X., MacKinnon, R. Functional analysis of Kv1.2 and paddle chimera Kv channels in planar lipid bilayers. J. Mol. Biol. 382, 24 (2008).
- Cohen, F. S., Akabas, M. H., Zimmerberg, J., Finkelstein, A. Parameters affecting the fusion of unilamellar phospholipid vesicles with planar bilayer membranes. The Journal of Cell Biology. 98, 1054 (1984).
- Smith, G. P., Petrenko, V. A. Phage Display. Chem. Rev. 97, 391-39 (1997).
- McGuire, M. J., Li, S., Brown, K. C. Biopanning of phage displayed peptide libraries for the isolation of cell-specific ligands. Methods Mol. Biol. 504, 291 (2009).
- Rigaud, J. L. Membrane proteins: functional and structural studies using reconstituted proteoliposomes and 2-D crystals. Braz. J. Med. Biol. Res. 35, 753 (2002).
- Chami, M., et al. Use of octyl beta-thioglucopyranoside in two-dimensional crystallization of membrane proteins. J. Struct. Biol. 133, 64 (2001).
- Kuhlbrandt, W. Two-dimensional crystallization of membrane proteins. Q. Rev. Biophys. 25, 1 (1992).
- Rigaud, J. L., Levy, D. Reconstitution of membrane proteins into liposomes. Methods Enzymol. 372, 65 (2003).
- Walz, T., Grigorieff, N. Electron Crystallography of Two-Dimensional Crystals of Membrane Proteins. J. Struct. Biol. 121 (2), 142 (1998).
- Signorell, G. A., Kaufmann, T. C., Kukulski, W., Engel, A., Remigy, H. W. Controlled 2D crystallization of membrane proteins using methyl-beta-cyclodextrin. J. Struct. Biol. 157, 321 (2007).
- Vink, M., Derr, K., Love, J., Stokes, D. L., Ubarretxena-Belandia, I. A high-throughput strategy to screen 2D crystallization trials of membrane proteins. J. Struct. Biol. 160, 295 (2007).
- Iacovache, I., et al. The 2DX robot: a membrane protein 2D crystallization Swiss Army knife. J. Struct. Biol. 169, 370 (2010).
