وFlyBar: إدارة الكحول الذباب
Summary
وقد برزت ذبابة الفاكهة كنظام نموذج كبير للتشريح الأسس الخلوية والجزيئية من الاستجابات السلوكية للكحول. هنا نقدم بروتوكول لجمع البيانات حساسية الكحول في سياق الإيقاعية التي يمكن تطبيقها بسهولة على التجارب الأخرى ومناسبة تماما للبحوث الجامعية.
Abstract
ذبابة الفاكهة (ذبابة الفاكهة السوداء البطن) هي نموذج أنشئت لكلا البحوث الكحول والبيولوجيا الإيقاعية. في الآونة الأخيرة، وأظهرت لنا أن الساعة الإيقاعية ينظم حساسية الكحول، ولكن ليس تشكيل التسامح. هنا، نحن تصف بروتوكول لدينا في التفاصيل. يدار الكحول لالذباب باستخدام FlyBar. في هذا الإعداد، يتم خلط بخار الكحول المشبعة بالهواء مرطب في مجموعة النسب، وتدار على الذباب في أربعة أنابيب في وقت واحد. وتربى الذباب في ظل ظروف موحدة من أجل تقليل التباين بين مكررات. وتستخدم الذباب القديمة لمدة ثلاثة أيام من المورثات أو العلاجات المختلفة للتجارب، ويفضل عن طريق مطابقة الذباب من وجهتي نظر مختلفتين الوقت (على سبيل المثال، CT 5 و CT 17) إجراء مقارنات مباشرة ممكن. أثناء التجربة، ويتعرض الذباب لمدة 1 ساعة إلى نسبة محددة سلفا من بخار الكحول وعدد من الذباب الذي يحمل فقدان المنعكس التقويمي (LoRR) أو الحوار الاقتصادي الاستراتيجيتحسب أوجه كل 5 دقائق. ويمكن تحليل البيانات باستخدام ثلاثة أساليب إحصائية مختلفة. الأول هو لتحديد الوقت الذي 50٪ من الذباب فقدوا المنعكس المقوم واستخدام تحليل التباين (ANOVA) لتحديد ما إذا كانت توجد فروق ذات دلالة إحصائية بين نقاط الوقت. والثاني هو لتحديد النسبة المئوية التي تظهر الذباب LoRR بعد عدد معين من الدقائق، يعقبه تحليل ANOVA. الأسلوب الأخير هو تحليل كامل سلسلة مرات باستخدام الإحصاءات متعدد المتغيرات. ويمكن أيضا أن تستخدم بروتوكول للتجارب غير الإيقاعية أو المقارنات بين الأنماط الجينية.
Introduction
ذبابة الفاكهة السوداء البطن إظهار الاستجابات السلوكية للكحول ثنائي الطور (1) التي هي مماثلة لاستجابات الإنسان لهذا الدواء 2،3. عند التعرض الأولي لتركيزات منخفضة من الكحول، والذباب المعرض زيادة النشاط الحركي، والاستعاضة عن نقص في التنسيق الحركي، وفقدان السيطرة الوضعي والمقوم ردود الفعل (فقدان المنعكس التقويمي: LoRR)، والتخدير (الانعدام التام للنشاط الحركي في استجابة إلى التحفيز الميكانيكي) عن التعرض للكحول يتقدم 4-9. الساعة الإيقاعية الذاتية هو المغير قوية من حساسية الكحول وسمية كما لوحظ في الفئران 10،11، 12 الفئران، والبشر 13. وقد أظهرت التطورات الحديثة في مجال البحوث ذبابة الفاكهة على مدار الساعة الإيقاعية ينظم حساسية الكحول الحاد ولكن ليس الكحول التسامح 1. النهج الجينية القوية المتاحة في ذبابة الفاكهة من خلال دراسات متحولة والتلاعب المعدلة وراثيا من المكانيةوالزمانية التعبير الجيني توفير نظام يسمح التقدم السريع في تحديد الآليات الخلوية والجزيئية الكامنة لسلوكيات معقدة. استخدام ذبابة الفاكهة كأداة التحقيق سمحت بإحراز تقدم ملموس في فهم بيولوجيا الأعصاب الكحول التي يمكن أن تترجم بسرعة إلى الثدييات 14-16. من أجل تسهيل فهم الآليات الجزيئية التي من خلالها الساعة اليومية ينظم حساسية الكحول وبشكل موحد لقياس الاستجابات السلوكية عبر نقاط زمنية الإيقاعية، بروتوكول إدارة الكحول مناسبة للاستخدام في ظروف الإضاءة الخافتة الحمراء هو مطلوب. لذبابة الفاكهة، يمكن أن تدار من خلال مكملات غذائية الكحول التعرض المزمن أو موثوق من خلال ادارتها الكحول في شكل بخار عن التعرض الحاد. هنا، نحن تصف بروتوكول الإدارة الكحول مناسبة لتقييم تعديل الساعة البيولوجية للتخفيف من بين المنعكس التقويمي (LoRR) 1 وكذلكالتخدير.
ومجرور الذباب مع 12 ساعة: 12 ساعة دورات LD عند درجة حرارة ثابتة، ثم نقل إلى نظام الضوء الخاضعة للرقابة ل2-5 أيام اعتمادا على مسألة تجريبية. ويتعرض الذباب لبخار الإيثانول في جهاز يعرف باسم FlyBar. في هذا الجهاز، وفقاعات كميات محددة من الهواء من خلال الماء والكحول؛ الأبخرة ثم يتم خلط وجهت إلى السكن قارورة الذباب. كل 5 دقائق الذباب وسجل للالرقم الذي فشل لعرض المقوم ردود الفعل أو أصبحت مخدرا. وتحسب النسب المئوية لLoRR كل نقطة زمنية ومقارنة بين نقاط الوقت الإيقاعية أو بين سلالات الذباب. بساطة وموثوقية التسليم الكحول باستخدام الكحول تسليم FlyBar جنبا إلى جنب مع خيارات التحليل السلوكي يوفر فائدة كبيرة للتجارب التي أجريت في ظل ظروف الإيقاعية الظلام.
Protocol
Representative Results
Discussion
تكاليف تعاطي الكحول والإدمان على الكحول بالنسبة للمجتمع هائلة، سواء من حيث التكاليف البشرية والاقتصادية 30،31 29. ذبابة الفاكهة كنموذج يوفر نظام سريع وتنوعا لدراسة الاستجابات السلوكية بسرعة من عدد كبير من الأفراد وعلى هذا النحو وقد استخدم على نطاق واسع على …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقدمت التمويل لهذا البحث من قبل برنامج جائزة في علم الأعصاب من ولاية فلوريدا كلية الطب بجامعة وبدعم من وزارة العلوم البيولوجية في الاتحاد السوفيتي السابق. تم توفير التمويل الإضافي من قبل غرانت في والمعونة من صندوق أبحاث الكحول المشروبات المصنعة.
Materials
| Alcohol 190 proof | Various | ||
| Name of Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Aerator | Local pet store | We use Whisper 60 | |
| Silicone tubing 1/8” | VWR | 408060-0030 | |
| 120° Y Connector | VWR | 82017-256 | |
| Quick disconnects | VWR | 46600-048 | |
| Plastic tube clamps | Bell-art products | 132250000 | Either this or next |
| Miniature Air Regulator | McMaster-Carr | 8727K11 | Either this or previous |
| Miniature Air Regulator Mounting Bracket | McMaster-Carr | 9891K66 | |
| Gilmont size 12 flow meter | VWR | 29895-242 | |
| Tool clips | McMaster-Carr | 1722A43 | To hold flow meters |
| Vial | VWR | 89092-722 | |
| Rubber stopper with two holes | VWR | 59585-186 | Fits in vials |
| 5 mm Pyrex Glass tubes | Trikinetics | PGT5x65 | Fits best in previous stopper. |
| Teflon tape | Hardware store | To achieve snug fit in stoppers if necessary | |
| Rubber stopper with two holes | VWR | 59582-122 | Fits our bottles |
| Disposable glass pipets | VWR | 53283-768 | Cut to length and bend by heating |
| Very fine nylon netting | VWR | Various | |
| 15 watt bulbs | Hardware store | Overhead red light | |
| Photographic red safe light filters | Overhead red light | ||
| Mini Flashlights with red filters | Mag-light |
References
- Linde, K., Lyons, L. C. Circadian modulation of acute alcohol sensitivity but not acute tolerance in Drosophila. Chronobiol. Int. 28, 397-406 (2011).
- Kaun, K. R., Azanchi, R., Maung, Z., Hirsh, J., Heberlein, U. A Drosophila model for alcohol reward. Nat Neurosci. 14, 612-619 (2011).
- Shohat-Ophir, G., Kaun, K. R., Azanchi, R., Mohammed, H., Heberlein, U. Sexual deprivation increases ethanol intake in Drosophila. Science. 335, 1351-1355 (2012).
- Bellen, H. J. The fruit fly: A model organism to study the genetics of alcohol abuse and addiction. Cell. 93, 909-912 (1998).
- Guarnieri, D. J., Heberlein, U. Drosophila melanogaster, a genetic model system for alcohol research. International Review of Neurobiology. 54, 203-232 (2003).
- Scholz, H. Intoxicated fly brains: Neurons mediating ethanol-induced behaviors. J. Neurogenet. 23, 111-119 (2009).
- Wolf, F. W., Rodan, A. R., Tsai, L. T. Y., Heberlein, U. High-resolution analysis of ethanol-induced locomotor stimulation in Drosophila. J. Neurosci. 22, 11035-11044 (2002).
- Schumann, G., Spanagel, R., Mann, K. Candidate genes for alcohol dependence: Animal studies. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 27, 880-888 (2003).
- Singh, C. M., Heberlein, U. Genetic control of acute ethanol-induced behaviors in Drosophila. Alcohol Clin Exp Res. 24, 1127-1136 (2000).
- Perreau-Lenz, S., Zghoul, T., de Fonseca, F. R., Spanagel, R., Bilbao, A. Circadian regulation of central ethanol sensitivity by the mPer2 gene. Addiction Biology. 14, 253-259 (2009).
- Brager, A. J., Prosser, R. A., Glass, J. D. Circadian and acamprosate modulation of elevated ethanol drinking in mPer2 clock gene mutant mice. Chronobiol. Int. 28, 664-672 (2011).
- Sinclair, J. D., Geller, I. Ethanol consumption by rats under different lighting conditions. Science. 175, 1143-1144 (1972).
- Danel, T., Jeanson, R., Touitou, Y. Temporal pattern in consumption of the first drink of the day in alcohol-dependent persons. Chronobiol. Int. 20, 1093-1102 (2003).
- Kapfhamer, D., et al. Taok2 controls behavioral response to ethanol in mice. Genes, brain, and behavior. 12 (1), 87-97 (2012).
- Lasek, A. W., et al. An evolutionary conserved role for anaplastic lymphoma kinase in behavioral responses to ethanol. PLoS One. 6, 226-236 (2011).
- Lasek, A. W., Giorgetti, F., Berger, K. H., Tayor, S., Heberlein, U. Lmo genes regulate behavioral responses to ethanol in Drosophila melanogaster and the mouse. Alcohol Clin Exp Res. 35, 1600-1606 (2011).
- Lyons, L. C., Roman, G. Circadian modulation of short-term memory in Drosophila. Learning & Memory. 16, 19-27 (2009).
- Hamblen-Coyle, M. J., Wheeler, D. A., Rutila, J. E., Rosbash, M., Hall, J. C. Behavior of period-altered circadian-rhythm mutants of Drosophila in ligh-dark cycles (Diptera Drosophilidae). J. Insect Behav. 5, 417-446 (1992).
- Konopka, R. J., Pittendrigh, C., Orr, D. Reciprocal behavior associated with altered homeostasis and photosensitivity of Drosophila clock mutants. J. Neurogenet. 6, 1-10 (1989).
- Power, J. M., Ringo, J. M., Dowse, H. B. The effects of period mutations and light on the activity rhythms of Drosophila melanogaster. Journal of Biological Rhythms. 10, 267-280 (1995).
- Yoshii, T., et al. Temperature cycles drive Drosophila circadian oscillation in constant light that otherwise induces behavioural arrhythmicity. Eur. J. Neurosci. 22, 1176-1184 (2005).
- Berger, K. H., Heberlein, U., Moore, M. S. Rapid and chronic: two distinct forms of ethanol tolerance in Drosophila. Alcohol Clin Exp Res. 28, 1469-1480 (2004).
- Scholz, H., Ramond, J., Singh, C. M., Heberlein, U. Functional ethanol tolerance in Drosophila. Neuron. 28, 261-271 (2000).
- Kong, E. C., et al. Ethanol-regulated genes that contribute to ethanol sensitivity and rapid tolerance in Drosophila. Alcohol Clin Exp Res. 34, 302-316 (2010).
- Borycz, J., Borycz, J., Kubow, A., Lloyd, V., Meinertzhagen, I. Drosophila ABC transporter mutants white, brown and scarlet have altered contents and distribution of biogenic amines in the brain. J. Exp. Biol. 211, 3454-3466 (2008).
- Sitaraman, D., et al. Serotonin is necessary for place memory in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 5579-5584 (2008).
- Bainton, R. J., et al. Dopamine modulates acute responses to cocaine, nicotine and ethanol in Drosophila. Current Biology. 10, 187-194 (2000).
- Kong, E. C., et al. A pair of dopamine neurons target the D1-like dopamine receptor DopR in the central complex to promote ethanol-stimulated locomotion in Drosophila. Plos One. 5, (2010).
- Xu, J., Kochanek, K. D., Murphy, S. L., Tejada-Vera, B. . Deaths: Final data for 2007. , (2010).
- . The National Center on Addiction and Substance Abuse. Shoveling up II: The impact of substance abuse on federal, state and local budgets. , (2009).
- NIAAA, Estimated economic costs of alcohol abuse in the United States. , (1992).
- Devineni, A. V., Heberlein, U. Preferential ethanol consumption in Drosophila models features of addiction. Current Biology. 19, 2126-2132 (2009).
- Devineni, A. V., Heberlein, U. Addiction-like behavior in Drosophila. Communicative & Integrative Biology. 3, 357-359 (2010).
- Rodan, A. R., Rothenfluh, A. The genetics of behavioral alcohol responses in Drosophila. International Review of Neurobiology. 91, 25-51 (2010).
- Boothroyd, C. E., Young, M. W., Pfaff, D. W., Kieffer, B. Molecular and Biophysical Mechanisms of Arousal, Alertness, and Attention. Annals of the New York Academy of Sciences. 1129, 350-357 (2008).
- Nitabach, M. N., Taghert, P. H. Organization of the Drosophila circadian control circuit. Current Biology. 18, 84-93 (2008).
- Sheeba, V. The Drosophila melanogaster circadian pacemaker circuit. J. Genet. 87, 485-493 (2008).
- Cohan, F. M., Graf, J. -. D. Latitudinal cline in Drosophila melanogaster for knockdown resistance to ethanol fumes and for rates of response to selection for further resistance. Evolution. , 278-293 (1985).
- Moore, M. S., et al. Ethanol intoxication in Drosophila: Genetic and pharmacological evidence for regulation by the cAMP signaling pathway. Cell. 93, 997-1007 (1998).
- Berger, K. H., et al. Ethanol sensitivity and tolerance in long-term memory mutants of Drosophila melanogaster. Alcohol Clin Exp Res. 32, 895-908 (2008).
- Pohl, J. B., et al. Circadian Genes Differentially Affect Tolerance to Ethanol. in Drosophila. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. , (2013).
- Bhandari, P., Kendler, K. S., Bettinger, J. C., Davies, A. G., Grotewiel, M. An assay for evoked locomotor behavior in Drosophila reveals a role for integrins in ethanol sensitivity and rapid ethanol tolerance. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 33, 1794-1805 (2009).
- Rothenfluh, A., et al. Distinct behavioral responses to ethanol are regulated by alternate RhoGAP18B isoforms. Cell. 127, (1016).
