Flybar: Sineklerin için Alkol yönetme
Summary
Drosophila alkole davranışsal yanıtların hücresel ve moleküler temellerini kesme için önemli bir model sistem olarak ortaya çıkmıştır. İşte biz kolayca başka deneylere uygulanabilir ve lisans araştırma için çok uygun bir sirkadiyen bağlamda alkol duyarlılık verilerinin toplanması için bir protokol mevcut.
Abstract
Meyve sinekleri (Drosophila melanogaster) alkol araştırma ve sirkadiyen biyoloji hem de kurulu bir modeldir. Son zamanlarda, sirkadiyen saat alkol hassasiyeti değil, tolerans oluşumu modüle gösterdi. Burada ayrıntılı olarak bizim protokol açıklar. Alkol flybar kullanarak sinekler uygulanır. Bu kurulumda, doymuş alkol buharı grubu oranlarda nemlendirilmiş hava ile karıştırılır ve aynı anda dört tüplerde sinekler uygulanmıştır. Sinekler çoğaltır varyasyonu en aza indirmek için, standart koşullar altında yetiştirilir. Farklı genotipleri ya da muamele maddelerinin üç günlük sinekler, tercihen doğrudan karşılaştırma yapmak mümkün bulunan iki farklı zaman noktalarında (örneğin, CT 5 ve CT 17) sinekleri eşleştirerek, deneyler için kullanılmıştır. Deney sırasında, sinekler refleks (lorr) düzeltilmesi en kaybı sergileyen alkol buharın önceden belirlenmiş bir yüzde ve sinekler sayısı 1 saat boyunca maruz veya sed ediliration her 5 dakikada sayılır. Veriler üç farklı istatistiksel yaklaşımlar kullanılarak analiz edilebilir. İlk sineklerin% 50'si doğrulma refleksini yitirmiş olan süreyi belirlemek ve önemli farklılıklar zaman noktaları arasında var olup olmadığını belirlemek için, bir varyans analizi (ANOVA) kullanmaktır. İkinci bir varyans analizi ve ardından bir dakikalık belirtilen sayıda sonra lorr göstermektedir yüzdesi sinekler belirlemektir. Son yöntem değişkenli istatistikleri kullanarak bütün zamanlar serisi analiz etmektir. Bu protokol, aynı zamanda genotipler arasında olmayan sirkadiyen deneyleri ya da karşılaştırma için kullanılabilir.
Introduction
Drosophila melanogaster bu ilaç 2,3 insan yanıtlarına benzer olan alkol 1 Bifazik davranışsal cevapları göstermektedir. Ve sedasyon (tepki motor aktivite eksikliği tamamlamak: alkol, düşük konsantrasyonlarda ilk maruz sonra, motor koordinasyon eksikliği, postural kontrolün kaybı ve doğrulma reflekslerinin (lorr düzeltilmesi refleks kaybı) yerine, sergi artan lokomotor aktivite uçar mekanik uyarıya) alkol maruz 4-9 ilerledikçe. Endojen sirkadiyen saat 10,11 fareler, sıçanlar 12 gözlenen gibi alkol duyarlılık ve toksisite güçlü bir modülatörü olan ve 13, insanlarda. Drosophila araştırma son gelişmeler sirkadiyen saat akut alkol duyarlılığı değil alkol toleransı 1 modüle göstermiştir. Mutant çalışmaları ve uzaysal transjenik manipülasyon yoluyla Drosophila mevcut güçlü genetik yaklaşımlarve zamansal gen ekspresyon karmaşık davranışların altında yatan hücresel ve moleküler mekanizmaları belirlenmesinde hızlı bir ilerleme sağlayan bir sistem sağlar. Bir araştırma aracı olarak Drosophila kullanımı hızla memelilere 14-16 tercüme edilebilir alkol nörobiyoloji anlamada maddi gelişmeler izin verdi. Sirkadiyen saat alkol duyarlılık modüle, üzerinden moleküler mekanizmalar anlaşılmasını kolaylaştırmak ve muntazam bir sirkadiyen zaman noktalarındaki davranışsal tepkileri, loş kırmızı ışık koşullarında kullanım için uygun olan bir alkol yönetim protokol ölçmek için gereklidir. Drosophila, alkol kronik maruz kalma için güvenilebilir akut riskler için buhar şeklinde alkol idare yoluyla gıda takviyesi ile tatbik edilebilir. Burada, Kayıp-of-doğrulma refleksini (lorr) 1 sirkadiyen modülasyonu değerlendirilmesi yanı sıra uygun bir alkol yönetim protokolü açıklamaksedasyon.
Sabit bir sıcaklıkta, 12 saat LD döngüler ve daha sonra deney söz bağlı olarak 2-5 gün için, kontrollü ışık rejimi aktarılır: Sinekler 12 saat ile sürüklenir. Sinekler flybar olarak bilinen bir cihaz etanol buharına maruz kalmaktadır. Bu cihazda, hava kontrollü miktarda bir su ve alkol fokurdatıldı edilir; buharlar, daha sonra bir şişe yuva sinekler karıştırılır ve yönlendirilir. Sinekler dk her 5 refleksleri doğrulma veya sedasyon haline gelmiş görüntülemek için başarısız numarası için puanlanır. Her zaman noktası için lorr yüzdeler sirkadiyen zaman noktaları arasında ya da sinek suşları arasında hesaplanmış ve karşılaştırılmıştır. Davranış analizi seçenekleri ile birlikte Flybar alkol teslim kullanılarak alkol teslimat basitliği ve güvenilirliği karanlık koşulları altında gerçekleştirilmiştir sirkadiyen deneyler için önemli bir fayda sağlar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Alkol ve toplum için alkolizm maliyetler de 29 insan ve ekonomik maliyetleri açısından, muazzam 30,31. Drosophila bir model olarak hızla bireylerin çok sayıda davranışsal tepkileri incelemek için hızlı ve çok yönlü bir sistem sunar ve gibi yaygın alkol 5,7,32-34 ve sirkadiyen araştırma 35-37 her ikisi için de kullanılmıştır.
Burada, sirkadiyen koşullar altında yetişkin sinek alkol buharı kontrol uygulanması içi…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu araştırma için fon Florida State Üniversitesi Tıp Fakültesi ve FSU Biyolojik Bilimler Bölümü'nden destek Neuroscience Ödülü bir Programı tarafından sağlanmıştır. Ek Finansman bir Grant-in-Aid Alkollü İçki Üretici Araştırma Fonu tarafından sağlanmıştır.
Materials
| Alcohol 190 proof | Various | ||
| Name of Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Aerator | Local pet store | We use Whisper 60 | |
| Silicone tubing 1/8” | VWR | 408060-0030 | |
| 120° Y Connector | VWR | 82017-256 | |
| Quick disconnects | VWR | 46600-048 | |
| Plastic tube clamps | Bell-art products | 132250000 | Either this or next |
| Miniature Air Regulator | McMaster-Carr | 8727K11 | Either this or previous |
| Miniature Air Regulator Mounting Bracket | McMaster-Carr | 9891K66 | |
| Gilmont size 12 flow meter | VWR | 29895-242 | |
| Tool clips | McMaster-Carr | 1722A43 | To hold flow meters |
| Vial | VWR | 89092-722 | |
| Rubber stopper with two holes | VWR | 59585-186 | Fits in vials |
| 5 mm Pyrex Glass tubes | Trikinetics | PGT5x65 | Fits best in previous stopper. |
| Teflon tape | Hardware store | To achieve snug fit in stoppers if necessary | |
| Rubber stopper with two holes | VWR | 59582-122 | Fits our bottles |
| Disposable glass pipets | VWR | 53283-768 | Cut to length and bend by heating |
| Very fine nylon netting | VWR | Various | |
| 15 watt bulbs | Hardware store | Overhead red light | |
| Photographic red safe light filters | Overhead red light | ||
| Mini Flashlights with red filters | Mag-light |
References
- Linde, K., Lyons, L. C. Circadian modulation of acute alcohol sensitivity but not acute tolerance in Drosophila. Chronobiol. Int. 28, 397-406 (2011).
- Kaun, K. R., Azanchi, R., Maung, Z., Hirsh, J., Heberlein, U. A Drosophila model for alcohol reward. Nat Neurosci. 14, 612-619 (2011).
- Shohat-Ophir, G., Kaun, K. R., Azanchi, R., Mohammed, H., Heberlein, U. Sexual deprivation increases ethanol intake in Drosophila. Science. 335, 1351-1355 (2012).
- Bellen, H. J. The fruit fly: A model organism to study the genetics of alcohol abuse and addiction. Cell. 93, 909-912 (1998).
- Guarnieri, D. J., Heberlein, U. Drosophila melanogaster, a genetic model system for alcohol research. International Review of Neurobiology. 54, 203-232 (2003).
- Scholz, H. Intoxicated fly brains: Neurons mediating ethanol-induced behaviors. J. Neurogenet. 23, 111-119 (2009).
- Wolf, F. W., Rodan, A. R., Tsai, L. T. Y., Heberlein, U. High-resolution analysis of ethanol-induced locomotor stimulation in Drosophila. J. Neurosci. 22, 11035-11044 (2002).
- Schumann, G., Spanagel, R., Mann, K. Candidate genes for alcohol dependence: Animal studies. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 27, 880-888 (2003).
- Singh, C. M., Heberlein, U. Genetic control of acute ethanol-induced behaviors in Drosophila. Alcohol Clin Exp Res. 24, 1127-1136 (2000).
- Perreau-Lenz, S., Zghoul, T., de Fonseca, F. R., Spanagel, R., Bilbao, A. Circadian regulation of central ethanol sensitivity by the mPer2 gene. Addiction Biology. 14, 253-259 (2009).
- Brager, A. J., Prosser, R. A., Glass, J. D. Circadian and acamprosate modulation of elevated ethanol drinking in mPer2 clock gene mutant mice. Chronobiol. Int. 28, 664-672 (2011).
- Sinclair, J. D., Geller, I. Ethanol consumption by rats under different lighting conditions. Science. 175, 1143-1144 (1972).
- Danel, T., Jeanson, R., Touitou, Y. Temporal pattern in consumption of the first drink of the day in alcohol-dependent persons. Chronobiol. Int. 20, 1093-1102 (2003).
- Kapfhamer, D., et al. Taok2 controls behavioral response to ethanol in mice. Genes, brain, and behavior. 12 (1), 87-97 (2012).
- Lasek, A. W., et al. An evolutionary conserved role for anaplastic lymphoma kinase in behavioral responses to ethanol. PLoS One. 6, 226-236 (2011).
- Lasek, A. W., Giorgetti, F., Berger, K. H., Tayor, S., Heberlein, U. Lmo genes regulate behavioral responses to ethanol in Drosophila melanogaster and the mouse. Alcohol Clin Exp Res. 35, 1600-1606 (2011).
- Lyons, L. C., Roman, G. Circadian modulation of short-term memory in Drosophila. Learning & Memory. 16, 19-27 (2009).
- Hamblen-Coyle, M. J., Wheeler, D. A., Rutila, J. E., Rosbash, M., Hall, J. C. Behavior of period-altered circadian-rhythm mutants of Drosophila in ligh-dark cycles (Diptera Drosophilidae). J. Insect Behav. 5, 417-446 (1992).
- Konopka, R. J., Pittendrigh, C., Orr, D. Reciprocal behavior associated with altered homeostasis and photosensitivity of Drosophila clock mutants. J. Neurogenet. 6, 1-10 (1989).
- Power, J. M., Ringo, J. M., Dowse, H. B. The effects of period mutations and light on the activity rhythms of Drosophila melanogaster. Journal of Biological Rhythms. 10, 267-280 (1995).
- Yoshii, T., et al. Temperature cycles drive Drosophila circadian oscillation in constant light that otherwise induces behavioural arrhythmicity. Eur. J. Neurosci. 22, 1176-1184 (2005).
- Berger, K. H., Heberlein, U., Moore, M. S. Rapid and chronic: two distinct forms of ethanol tolerance in Drosophila. Alcohol Clin Exp Res. 28, 1469-1480 (2004).
- Scholz, H., Ramond, J., Singh, C. M., Heberlein, U. Functional ethanol tolerance in Drosophila. Neuron. 28, 261-271 (2000).
- Kong, E. C., et al. Ethanol-regulated genes that contribute to ethanol sensitivity and rapid tolerance in Drosophila. Alcohol Clin Exp Res. 34, 302-316 (2010).
- Borycz, J., Borycz, J., Kubow, A., Lloyd, V., Meinertzhagen, I. Drosophila ABC transporter mutants white, brown and scarlet have altered contents and distribution of biogenic amines in the brain. J. Exp. Biol. 211, 3454-3466 (2008).
- Sitaraman, D., et al. Serotonin is necessary for place memory in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 5579-5584 (2008).
- Bainton, R. J., et al. Dopamine modulates acute responses to cocaine, nicotine and ethanol in Drosophila. Current Biology. 10, 187-194 (2000).
- Kong, E. C., et al. A pair of dopamine neurons target the D1-like dopamine receptor DopR in the central complex to promote ethanol-stimulated locomotion in Drosophila. Plos One. 5, (2010).
- Xu, J., Kochanek, K. D., Murphy, S. L., Tejada-Vera, B. . Deaths: Final data for 2007. , (2010).
- . The National Center on Addiction and Substance Abuse. Shoveling up II: The impact of substance abuse on federal, state and local budgets. , (2009).
- NIAAA, Estimated economic costs of alcohol abuse in the United States. , (1992).
- Devineni, A. V., Heberlein, U. Preferential ethanol consumption in Drosophila models features of addiction. Current Biology. 19, 2126-2132 (2009).
- Devineni, A. V., Heberlein, U. Addiction-like behavior in Drosophila. Communicative & Integrative Biology. 3, 357-359 (2010).
- Rodan, A. R., Rothenfluh, A. The genetics of behavioral alcohol responses in Drosophila. International Review of Neurobiology. 91, 25-51 (2010).
- Boothroyd, C. E., Young, M. W., Pfaff, D. W., Kieffer, B. Molecular and Biophysical Mechanisms of Arousal, Alertness, and Attention. Annals of the New York Academy of Sciences. 1129, 350-357 (2008).
- Nitabach, M. N., Taghert, P. H. Organization of the Drosophila circadian control circuit. Current Biology. 18, 84-93 (2008).
- Sheeba, V. The Drosophila melanogaster circadian pacemaker circuit. J. Genet. 87, 485-493 (2008).
- Cohan, F. M., Graf, J. -. D. Latitudinal cline in Drosophila melanogaster for knockdown resistance to ethanol fumes and for rates of response to selection for further resistance. Evolution. , 278-293 (1985).
- Moore, M. S., et al. Ethanol intoxication in Drosophila: Genetic and pharmacological evidence for regulation by the cAMP signaling pathway. Cell. 93, 997-1007 (1998).
- Berger, K. H., et al. Ethanol sensitivity and tolerance in long-term memory mutants of Drosophila melanogaster. Alcohol Clin Exp Res. 32, 895-908 (2008).
- Pohl, J. B., et al. Circadian Genes Differentially Affect Tolerance to Ethanol. in Drosophila. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. , (2013).
- Bhandari, P., Kendler, K. S., Bettinger, J. C., Davies, A. G., Grotewiel, M. An assay for evoked locomotor behavior in Drosophila reveals a role for integrins in ethanol sensitivity and rapid ethanol tolerance. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 33, 1794-1805 (2009).
- Rothenfluh, A., et al. Distinct behavioral responses to ethanol are regulated by alternate RhoGAP18B isoforms. Cell. 127, (1016).
