Den Flybar: Forvaltning Alkohol til Flies

Summary

Drosophila har vist sig som en markant model system til at dissekere de cellulære og molekylære fundament for adfærdsmæssige reaktioner på alkohol. Her præsenterer vi en protokol for indsamling af alkohol følsomhed data i en døgnrytmen sammenhæng, der nemt kan anvendes på andre eksperimenter og er velegnet til bachelor forskning.

Abstract

Bananfluer (Drosophila melanogaster) er en etableret model for både alkohol forskning og døgnrytmen biologi. For nylig viste vi, at døgnrytmen ur modulerer alkohol følsomhed, men ikke dannelsen af ​​tolerance. Her beskriver vi vores protokol i detaljer. Alkohol administreres til fluer ved hjælp af Flybar. I denne opsætning er mættet alkohol damp blandet med befugtet luft i sæt proportioner, og administreres til fluer i fire rør samtidigt. Fluer opdrættes under standardiserede betingelser for at minimere variation mellem replikater. Tre dage gamle fluer af forskellige genotyper eller behandlinger anvendes til forsøgene, fortrinsvis ved at matche fluer to forskellige tidspunkter (f.eks CT 5 og CT 17), hvilket gør direkte sammenligninger. Under eksperimentet er fluer eksponeret i 1 time til den forudbestemte procentdel af alkohol damp og antallet af fluer, der udviser tab af vridningsrefleks (Lorr) eller sedation tælles hver 5 min. De data kan analyseres ved hjælp af tre forskellige statistiske metoder. Den første er at bestemme det tidspunkt, hvor 50% af fluerne har mistet deres opretningsrefleksen og bruge en analyse af varians (ANOVA) for at afgøre, om der er væsentlige forskelle mellem tidspunkter. Den anden er at bestemme den procentvise fluer, der viser Lorr efter et bestemt antal minutter, efterfulgt af en ANOVA-analyse. Den sidste metode er at analysere hele tidsserier hjælp multivariat statistik. Protokollen kan også bruges til ikke-døgnrytmen eksperimenter eller sammenligninger mellem genotyper.

Introduction

Drosophila melanogaster demonstrere dobbeltfasede adfærdsmæssige reaktioner på alkohol ^1, som er analoge til de menneskelige reaktioner på dette stof ^2,3. Ved første eksponering for lave koncentrationer af alkohol, fluer udviser forøget bevægelsesaktivitet, erstattet af en manglende koordinering motor, tab af postural kontrol og oprettende reflekser (tab af stabilitetsrefleks: Lorr) og sedation (komplet mangel på motorisk aktivitet i svar til mekanisk stimulering) udsættelse for alkohol skrider ^4-9. Den endogene døgnrytmen ur er en stærk modulator af alkohol følsomhed og toksicitet som observeret i mus ^10,11, rotter ^12, og mennesker ^13.. Nylige fremskridt i Drosophila forskning har vist, at døgnrytmen ur modulerer akut alkohol følsomhed, men ikke alkohol tolerance ^1. De kraftige genetiske metoder til rådighed i Drosophila gennem mutant undersøgelser og transgene manipulationer af rumligeog tidsmæssig genekspression giver et system, der tillader hurtige fremskridt med at identificere de underliggende cellulære og molekylære mekanismer for kompleks adfærd. Brugen af Drosophila som en undersøgende værktøj er tilladt materielle fremskridt i forståelsen af alkohol neurobiologi, som hurtigt kan oversættes til pattedyr ^14-16. For at lette forståelsen af ​​de molekylære mekanismer gennem hvilke døgnrytmen ur modulerer alkohol følsomhed og til ensartet at måle adfærdsmæssige reaktioner på tværs af døgnrytmen tidspunkter, en alkohol administration protokol er egnet til anvendelse i svagt rødt lys er påkrævet. For Drosophila kan alkohol administreres gennem fødevarer tilskud til kronisk eksponering eller pålideligt gennem administration af alkohol i form af damp ved akutte eksponeringer. Her beskriver vi en alkohol administration protokol egnet til vurdering af døgnrytmen modulation af tab af vridningsrefleksen (Lorr) ¹ samtsedation.

Fluer medføres med 12 timer: 12 timer LD cyklusser ved konstant temperatur og derefter overført til en kontrolleret enkel ordning for 2-5 dage afhængig af den eksperimentelle spørgsmål. Fluer udsættes for ethanoldamp i en indretning kendt som Flybar. I denne anordning er kontrollerede mængder af luft bobles gennem vand og alkohol; dampene blandes derefter og ledes ind i et hætteglas indkapsling fluer. Hver 5 min fluerne er scoret for det antal, der undlader at vise oprettende reflekser eller er blevet bedøvet. Lorr procentsatser for hvert tidspunkt beregnes og sammenlignes blandt døgnrytmen tidspunkter eller mellem stammer af fluer. Enkeltheden og pålideligheden af ​​alkohol levering vha. Flybar alkohol levering kombineret med adfærdsmæssige muligheder analyse giver en betydelig fordel for døgnrytmen eksperimenter udført under mørke forhold.

Protocol

1.. Montering af Flybar Grundlag og overblik: Systemet er designet til at administrere kontrollerede procentdele af alkohol damp til fluer. Bemærk: Figur 1 giver en skematisk oversigt over Flybar set-up som beskrevet nedenfor i tre faser (samling af luftstrømmen, set-up af alkohol og vandflasker, og montering af observation hætteglas). Kort sagt er en konstant luftstrøm delt i to fraktioner, der er bobles gennem alkohol og vand, henholdsvis blandet, og administreres til 4 …

Representative Results

Døgnrytmen Modulation af alkohol følsomhed ved hjælp af 50% Lorr som markør. Et repræsentativt eksempel, der viser døgnrytmen graduering i alkohol følsomhed i løbet af dagen er beskrevet i figur 2.. Lorr blev målt til seks tidspunkter i løbet af 2. dag i DD i Canton-S og 50% Lorr blev bestemt for hvert tidspunkt. Analyse viste en signifikant effekt af tidspunktet på dagen (ANOVA: F 5,45 = 7,39, p <0,001, N = 6-10 per tidspunkt). F…

Discussion

Omkostningerne ved alkoholmisbrug og alkoholisme for samfundet er enorme, både i form af menneskelige ²⁹ og økonomiske omkostninger ^30,31. Drosophila som model tilbyder en hurtig og alsidigt system til hurtigt at undersøge de adfærdsmæssige reaktioner i et stort antal personer, og som sådan har været flittigt brugt til både alkohol ^5,7,32-34 og døgnrytmen forskning ^35-37.

Her beskrev vi en enkel protokol til kontrolleret administr…

Materials

Alcohol 190 proof	Various
Name of Material	Company	Catalog Number	Comments
Aerator	Local pet store		We use Whisper 60
Silicone tubing 1/8”	VWR	408060-0030
120° Y Connector	VWR	82017-256
Quick disconnects	VWR	46600-048
Plastic tube clamps	Bell-art products	132250000	Either this or next
Miniature Air Regulator	McMaster-Carr	8727K11	Either this or previous
Miniature Air Regulator Mounting Bracket	McMaster-Carr	9891K66
Gilmont size 12 flow meter	VWR	29895-242
Tool clips	McMaster-Carr	1722A43	To hold flow meters
Vial	VWR	89092-722
Rubber stopper with two holes	VWR	59585-186	Fits in vials
5 mm Pyrex Glass tubes	Trikinetics	PGT5x65	Fits best in previous stopper.
Teflon tape	Hardware store		To achieve snug fit in stoppers if necessary
Rubber stopper with two holes	VWR	59582-122	Fits our bottles
Disposable glass pipets	VWR	53283-768	Cut to length and bend by heating
Very fine nylon netting	VWR	Various
15 watt bulbs	Hardware store		Overhead red light
Photographic red safe light filters			Overhead red light
Mini Flashlights with red filters	Mag-light