De flybar: Toedienen Alcohol te Flies
Summary
Drosophila heeft zich ontpopt als een belangrijk modelsysteem voor het ontleden van de cellulaire en moleculaire onderbouwing van gedragsreacties op alcohol. Hier presenteren we een protocol voor het verzamelen van alcohol gevoelige gegevens in een circadiane context die gemakkelijk kan worden toegepast op andere experimenten en is goed geschikt voor gegradueerdenonderzoek.
Abstract
Fruitvliegen (Drosophila melanogaster) zijn een gevestigd model voor zowel alcohol onderzoek en circadiane biologie. Onlangs hebben we aangetoond dat de circadiane klok moduleert alcohol gevoeligheid, maar niet de vorming van tolerantie. Hier beschrijven we ons protocol in detail. Alcohol wordt toegediend aan het vliegen met de flybar. In deze opstelling wordt verzadigd alcohol damp vermengd met bevochtigde lucht in set proporties, en toegediend aan de vliegen in vier tubes tegelijk. Vliegen zijn gefokt onder gestandaardiseerde omstandigheden om variatie tussen de herhalingen minimaliseren. Drie dagen oude vliegen van verschillende genotypen of behandelingen worden gebruikt voor experimenten voorkeur congruente vliegen twee verschillende tijdstippen (bijv. CT CT 5 en 17) die kunnen vergelijken. Tijdens het experiment zijn vliegen blootgesteld gedurende 1 uur tot het vooraf bepaalde percentage alcohol damp en het aantal vliegen die het verlies van oprichtreflex (lorr) vertonen of sedatie worden geteld om de 5 minuten. De gegevens kunnen worden geanalyseerd met behulp van drie verschillende statistische benaderingen. De eerste is de tijd waarbij 50% van de vliegen de oprichtreflex verloren bepalen en gebruiken van een analyse van de variantie (ANOVA) om te bepalen of significante verschillen tussen tijdstippen. De tweede is om het percentage vliegen die lorr tonen na een bepaald aantal minuten, gevolgd door een ANOVA-analyse te bepalen. De laatste methode is om de hele tijd series met behulp van multivariate statistische analyse. Het protocol kan worden gebruikt voor niet-circadiane experimenten of vergelijkingen tussen genotypen.
Introduction
Drosophila melanogaster demonstreren bifasische gedragsreacties op alcohol 1 die analoog is aan de menselijke reacties op dit medicijn 2,3 zijn. Na de eerste blootstelling aan lage concentraties van alcohol, vliegt vertonen verhoogde bewegingsactiviteit, vervangen door een gebrek aan motorische coördinatie, het verlies van posturale controle en oprichtende reflexen (meer verlies van evenwicht Reflex: lorr), en sedatie (volledige gebrek aan motorische activiteit in reactie mechanische stimulatie) blootstelling aan alcohol vordert 4-9. De endogene circadiane klok is een sterke modulator alcohol gevoeligheid en toxiciteit waargenomen bij muizen 10,11, ratten 12 en 13 mens. Recente ontwikkelingen in Drosophila onderzoek is gebleken dat de circadiane klok moduleert acute alcohol gevoeligheid, maar geen alcohol tolerantie 1. De krachtige genetische benaderingen beschikbaar in Drosophila mutant via studies en transgene manipulaties van de ruimtelijkeen tijdelijke genexpressie tot een systeem dat snelle vooruitgang bij het identificeren van de onderliggende cellulaire en moleculaire mechanismen voor complexe gedrag maakt. Het gebruik van Drosophila als onderzoeksinstrument is toegestaan substantiële vooruitgang in het begrip alcohol neurobiologie die snel kunnen worden vertaald naar zoogdieren 14-16. Om het begrip van de moleculaire mechanismen waardoor de circadiane klok moduleert alcohol gevoeligheid te vergemakkelijken en om gedragsreacties over circadiane tijdstippen, een alcohol administratie protocol geschikt zijn voor gebruik bij weinig rood licht gelijkmatig te meten is vereist. Voor Drosophila, kan alcohol worden toegediend via de voeding suppletie voor chronische blootstelling of betrouwbaar door het toedienen van alcohol in de vorm van damp voor acute blootstelling. Hier, een alcohol administratie protocol geschikt zijn voor de beoordeling van de circadiane modulatie van verlies-van-oprichtreflex (lorr) 1 alsmede beschrijven wesedatie.
Vliegen worden meegevoerd met 12 uur: 12 uur LD cycli bij constante temperatuur en vervolgens overgebracht naar een gecontroleerde lichte regime voor 2-5 dagen, afhankelijk van de experimentele vraag. Vliegen worden blootgesteld aan ethanol damp in een apparaat dat bekend staat als de flybar. In deze inrichting worden gecontroleerde hoeveelheden lucht door water en alcohol; de dampen worden vervolgens gemengd en geleid in een flesje behuizing de vliegen. Elke 5 min de vliegen worden gescoord voor het nummer dat niet wordt weergegeven oprichtende reflexen of zijn geworden verdoofd. Lorr percentages voor elk tijdstip berekend en vergeleken tussen circadiane tijdstippen of tussen stammen van vliegen. De eenvoud en betrouwbaarheid van alcohol aflevering met behulp van de flybar alcohol levering in combinatie met gedrags-analyse opties biedt een significant voordeel voor circadiane experimenten uitgevoerd onder donkere omstandigheden.
Protocol
Representative Results
Discussion
De kosten van alcoholmisbruik en alcoholisme voor de samenleving is enorm, zowel in termen van menselijke 29 en economische kosten 30,31. Drosophila als model biedt een snelle en veelzijdige systeem om de gedragsreacties van een groot aantal individuen snel te onderzoeken en als zodanig is uitgebreid gebruikt voor zowel alcohol 5,7,32-34 en circadiane onderzoek 35-37.
Hier beschrijven we een eenvoudig protocol voor de gecontroleerde toedie…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Financiering voor dit onderzoek werd verstrekt door een Program in Neuroscience Award van de Florida State University College of Medicine en steun van de afdeling Biologische Wetenschappen aan FSU. Aanvullende financiering werd verstrekt door een Grant-in-Aid van Onderzoek Fonds de Alcohol Beverage fabrikant.
Materials
| Alcohol 190 proof | Various | ||
| Name of Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Aerator | Local pet store | We use Whisper 60 | |
| Silicone tubing 1/8” | VWR | 408060-0030 | |
| 120° Y Connector | VWR | 82017-256 | |
| Quick disconnects | VWR | 46600-048 | |
| Plastic tube clamps | Bell-art products | 132250000 | Either this or next |
| Miniature Air Regulator | McMaster-Carr | 8727K11 | Either this or previous |
| Miniature Air Regulator Mounting Bracket | McMaster-Carr | 9891K66 | |
| Gilmont size 12 flow meter | VWR | 29895-242 | |
| Tool clips | McMaster-Carr | 1722A43 | To hold flow meters |
| Vial | VWR | 89092-722 | |
| Rubber stopper with two holes | VWR | 59585-186 | Fits in vials |
| 5 mm Pyrex Glass tubes | Trikinetics | PGT5x65 | Fits best in previous stopper. |
| Teflon tape | Hardware store | To achieve snug fit in stoppers if necessary | |
| Rubber stopper with two holes | VWR | 59582-122 | Fits our bottles |
| Disposable glass pipets | VWR | 53283-768 | Cut to length and bend by heating |
| Very fine nylon netting | VWR | Various | |
| 15 watt bulbs | Hardware store | Overhead red light | |
| Photographic red safe light filters | Overhead red light | ||
| Mini Flashlights with red filters | Mag-light |
References
- Linde, K., Lyons, L. C. Circadian modulation of acute alcohol sensitivity but not acute tolerance in Drosophila. Chronobiol. Int. 28, 397-406 (2011).
- Kaun, K. R., Azanchi, R., Maung, Z., Hirsh, J., Heberlein, U. A Drosophila model for alcohol reward. Nat Neurosci. 14, 612-619 (2011).
- Shohat-Ophir, G., Kaun, K. R., Azanchi, R., Mohammed, H., Heberlein, U. Sexual deprivation increases ethanol intake in Drosophila. Science. 335, 1351-1355 (2012).
- Bellen, H. J. The fruit fly: A model organism to study the genetics of alcohol abuse and addiction. Cell. 93, 909-912 (1998).
- Guarnieri, D. J., Heberlein, U. Drosophila melanogaster, a genetic model system for alcohol research. International Review of Neurobiology. 54, 203-232 (2003).
- Scholz, H. Intoxicated fly brains: Neurons mediating ethanol-induced behaviors. J. Neurogenet. 23, 111-119 (2009).
- Wolf, F. W., Rodan, A. R., Tsai, L. T. Y., Heberlein, U. High-resolution analysis of ethanol-induced locomotor stimulation in Drosophila. J. Neurosci. 22, 11035-11044 (2002).
- Schumann, G., Spanagel, R., Mann, K. Candidate genes for alcohol dependence: Animal studies. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 27, 880-888 (2003).
- Singh, C. M., Heberlein, U. Genetic control of acute ethanol-induced behaviors in Drosophila. Alcohol Clin Exp Res. 24, 1127-1136 (2000).
- Perreau-Lenz, S., Zghoul, T., de Fonseca, F. R., Spanagel, R., Bilbao, A. Circadian regulation of central ethanol sensitivity by the mPer2 gene. Addiction Biology. 14, 253-259 (2009).
- Brager, A. J., Prosser, R. A., Glass, J. D. Circadian and acamprosate modulation of elevated ethanol drinking in mPer2 clock gene mutant mice. Chronobiol. Int. 28, 664-672 (2011).
- Sinclair, J. D., Geller, I. Ethanol consumption by rats under different lighting conditions. Science. 175, 1143-1144 (1972).
- Danel, T., Jeanson, R., Touitou, Y. Temporal pattern in consumption of the first drink of the day in alcohol-dependent persons. Chronobiol. Int. 20, 1093-1102 (2003).
- Kapfhamer, D., et al. Taok2 controls behavioral response to ethanol in mice. Genes, brain, and behavior. 12 (1), 87-97 (2012).
- Lasek, A. W., et al. An evolutionary conserved role for anaplastic lymphoma kinase in behavioral responses to ethanol. PLoS One. 6, 226-236 (2011).
- Lasek, A. W., Giorgetti, F., Berger, K. H., Tayor, S., Heberlein, U. Lmo genes regulate behavioral responses to ethanol in Drosophila melanogaster and the mouse. Alcohol Clin Exp Res. 35, 1600-1606 (2011).
- Lyons, L. C., Roman, G. Circadian modulation of short-term memory in Drosophila. Learning & Memory. 16, 19-27 (2009).
- Hamblen-Coyle, M. J., Wheeler, D. A., Rutila, J. E., Rosbash, M., Hall, J. C. Behavior of period-altered circadian-rhythm mutants of Drosophila in ligh-dark cycles (Diptera Drosophilidae). J. Insect Behav. 5, 417-446 (1992).
- Konopka, R. J., Pittendrigh, C., Orr, D. Reciprocal behavior associated with altered homeostasis and photosensitivity of Drosophila clock mutants. J. Neurogenet. 6, 1-10 (1989).
- Power, J. M., Ringo, J. M., Dowse, H. B. The effects of period mutations and light on the activity rhythms of Drosophila melanogaster. Journal of Biological Rhythms. 10, 267-280 (1995).
- Yoshii, T., et al. Temperature cycles drive Drosophila circadian oscillation in constant light that otherwise induces behavioural arrhythmicity. Eur. J. Neurosci. 22, 1176-1184 (2005).
- Berger, K. H., Heberlein, U., Moore, M. S. Rapid and chronic: two distinct forms of ethanol tolerance in Drosophila. Alcohol Clin Exp Res. 28, 1469-1480 (2004).
- Scholz, H., Ramond, J., Singh, C. M., Heberlein, U. Functional ethanol tolerance in Drosophila. Neuron. 28, 261-271 (2000).
- Kong, E. C., et al. Ethanol-regulated genes that contribute to ethanol sensitivity and rapid tolerance in Drosophila. Alcohol Clin Exp Res. 34, 302-316 (2010).
- Borycz, J., Borycz, J., Kubow, A., Lloyd, V., Meinertzhagen, I. Drosophila ABC transporter mutants white, brown and scarlet have altered contents and distribution of biogenic amines in the brain. J. Exp. Biol. 211, 3454-3466 (2008).
- Sitaraman, D., et al. Serotonin is necessary for place memory in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 5579-5584 (2008).
- Bainton, R. J., et al. Dopamine modulates acute responses to cocaine, nicotine and ethanol in Drosophila. Current Biology. 10, 187-194 (2000).
- Kong, E. C., et al. A pair of dopamine neurons target the D1-like dopamine receptor DopR in the central complex to promote ethanol-stimulated locomotion in Drosophila. Plos One. 5, (2010).
- Xu, J., Kochanek, K. D., Murphy, S. L., Tejada-Vera, B. . Deaths: Final data for 2007. , (2010).
- . The National Center on Addiction and Substance Abuse. Shoveling up II: The impact of substance abuse on federal, state and local budgets. , (2009).
- NIAAA, Estimated economic costs of alcohol abuse in the United States. , (1992).
- Devineni, A. V., Heberlein, U. Preferential ethanol consumption in Drosophila models features of addiction. Current Biology. 19, 2126-2132 (2009).
- Devineni, A. V., Heberlein, U. Addiction-like behavior in Drosophila. Communicative & Integrative Biology. 3, 357-359 (2010).
- Rodan, A. R., Rothenfluh, A. The genetics of behavioral alcohol responses in Drosophila. International Review of Neurobiology. 91, 25-51 (2010).
- Boothroyd, C. E., Young, M. W., Pfaff, D. W., Kieffer, B. Molecular and Biophysical Mechanisms of Arousal, Alertness, and Attention. Annals of the New York Academy of Sciences. 1129, 350-357 (2008).
- Nitabach, M. N., Taghert, P. H. Organization of the Drosophila circadian control circuit. Current Biology. 18, 84-93 (2008).
- Sheeba, V. The Drosophila melanogaster circadian pacemaker circuit. J. Genet. 87, 485-493 (2008).
- Cohan, F. M., Graf, J. -. D. Latitudinal cline in Drosophila melanogaster for knockdown resistance to ethanol fumes and for rates of response to selection for further resistance. Evolution. , 278-293 (1985).
- Moore, M. S., et al. Ethanol intoxication in Drosophila: Genetic and pharmacological evidence for regulation by the cAMP signaling pathway. Cell. 93, 997-1007 (1998).
- Berger, K. H., et al. Ethanol sensitivity and tolerance in long-term memory mutants of Drosophila melanogaster. Alcohol Clin Exp Res. 32, 895-908 (2008).
- Pohl, J. B., et al. Circadian Genes Differentially Affect Tolerance to Ethanol. in Drosophila. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. , (2013).
- Bhandari, P., Kendler, K. S., Bettinger, J. C., Davies, A. G., Grotewiel, M. An assay for evoked locomotor behavior in Drosophila reveals a role for integrins in ethanol sensitivity and rapid ethanol tolerance. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 33, 1794-1805 (2009).
- Rothenfluh, A., et al. Distinct behavioral responses to ethanol are regulated by alternate RhoGAP18B isoforms. Cell. 127, (1016).
