Flybar: Amministrazione alcol a Flies
Summary
Drosophila è emersa come sistema modello significativo per la dissezione delle basi cellulari e molecolari delle risposte comportamentali all'alcool. Qui vi presentiamo un protocollo per la raccolta di dati di sensibilità alcol in un contesto circadiano che può essere facilmente applicato ad altri esperimenti ed è particolarmente adatto per la ricerca di laurea.
Abstract
Moscerini della frutta (Drosophila melanogaster) sono un modello stabilito sia per la ricerca di alcol e di biologia circadiana. Recentemente, abbiamo dimostrato che l'orologio circadiano modula alcool sensibilità, ma non la formazione di tolleranza. Qui, descriviamo il nostro protocollo in dettaglio. L'alcol viene somministrato alle mosche con flybar. In questa configurazione, vapori di alcol saturo viene miscelato con aria umidificata in set proporzioni, e somministrato alle mosche in quattro tubi contemporaneamente. Le mosche sono allevati in condizioni standardizzate al fine di minimizzare la variazione tra le repliche. Tre giorni di età in linea di differenti genotipi o trattamenti vengono utilizzati per gli esperimenti, preferibilmente abbinando mosche di due diversi punti di tempo (ad esempio, CT 5 e CT 17) rendendo possibili confronti diretti. Durante l'esperimento, mosche sono esposti per 1 ora alla percentuale prestabilita del vapore di alcool e il numero di mosche che esporre la perdita del riflesso di raddrizzamento (Lorr) o sedzione sono conteggiati ogni 5 min. I dati possono essere analizzati utilizzando tre differenti approcci statistici. Il primo è quello di determinare il momento in cui il 50% delle mosche hanno perso il loro riflesso di raddrizzamento e utilizzare un analisi della varianza (ANOVA) per determinare se esistono differenze significative tra i punti temporali. Il secondo è quello di determinare le mosche percentuali che mostrano Lorr dopo un determinato numero di minuti, seguita da un'analisi ANOVA. L'ultimo metodo è quello di analizzare l'intera serie di volte con statistica multivariata. Il protocollo può essere utilizzato anche per esperimenti non circadiani o confronti tra i genotipi.
Introduction
Drosophila melanogaster dimostrare risposte comportamentali bifasico all'alcool 1 che sono analoghi a risposte umane a questo farmaco 2,3. Dopo l'esposizione iniziale a basse concentrazioni di alcol, mosche mostra un aumento dell'attività locomotoria, sostituito da una mancanza di coordinazione motoria, la perdita del controllo posturale e raddrizzamento riflessi (perdita del riflesso di raddrizzamento: Lorr), e la sedazione (completa mancanza di attività motoria in risposta alla stimolazione meccanica) come l'esposizione all'alcol progredisce 4-9. L'orologio circadiano endogeno è un modulatore di forte sensibilità alcol e tossicità osservata in topi, ratti 10,11 12, 13 e nell'uomo. I recenti progressi nella ricerca Drosophila hanno mostrato l'orologio circadiano modula la sensibilità acuta da alcol, ma non l'alcol tolleranza 1. I potenti approcci genetici disponibili a Drosophila attraverso studi mutanti e manipolazioni transgeniche di spazialee l'espressione genica temporale fornire un sistema che consente rapidi progressi nell'identificare i meccanismi cellulari e molecolari alla base di comportamenti complessi. L'uso di Drosophila come strumento di indagine ha consentito progressi sostanziali nella comprensione di alcol neurobiologia che possono essere rapidamente tradotti ai mammiferi 14-16. Al fine di facilitare la comprensione dei meccanismi molecolari attraverso i quali l'orologio circadiano modula la sensibilità di alcol e di misurare uniformemente risposte comportamentali attraverso punti di tempo circadiani, un protocollo di somministrazione di alcol adatto per l'uso in condizioni di luce rossa fioca è richiesto. Per Drosophila, l'alcool può essere somministrato attraverso integrazione alimentare per esposizione cronica o affidabile attraverso amministrare alcol in forma di vapore per esposizioni acute. Qui, descriviamo un protocollo di somministrazione alcool adatto per la valutazione della modulazione circadiano di perdita-di-riflesso di raddrizzamento (Lorr) 1 nonchésedazione.
Le mosche sono trascinate con 12 ore: 12 cicli hr LD a temperatura costante e poi trasferiti in un regime di luce controllata per 2-5 giorni a seconda della questione sperimentale. Mosche sono esposti al vapore di etanolo in un dispositivo noto come flybar. In questo dispositivo, quantità controllate di aria vengono gorgogliare attraverso acqua e alcool; i vapori vengono poi mescolati e diretti in un alloggiamento flaconcino in linea. Ogni 5 min in linea sono segnati per il numero che non riesce a visualizzare raddrizzamento riflessi o sono diventati sedato. Percentuali Lorr per ogni punto di tempo vengono calcolati e confrontati tra i punti temporali circadiani o tra ceppi di mosche. La semplicità e l'affidabilità di consegna alcol con la consegna di alcol flybar combinato con le opzioni di analisi comportamentale offre un vantaggio significativo per gli esperimenti circadiani condotti in condizioni di oscurità.
Protocol
Representative Results
Discussion
I costi di abuso di alcol e l'alcolismo per la società è enorme, sia in termini di costi umani ed economici 29 30,31. Drosophila come modello offre un sistema veloce e versatile per esaminare rapidamente le risposte comportamentali di un gran numero di individui e come tale è stato ampiamente utilizzato sia per l'alcol 5,7,32-34 e ricerca circadiano 35-37.
Qui, abbiamo descritto un protocollo semplice per la somministrazione controllata di…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Finanziamento per questa ricerca è stato fornito da un programma in Neuroscienze Award dalla Florida State University College of Medicine e il sostegno del Dipartimento di Scienze Biologiche a FSU. Il finanziamento aggiuntivo è stato fornito da un Grant-in-Aid dal Fondo di Ricerca di alcol Beverage Produttore.
Materials
| Alcohol 190 proof | Various | ||
| Name of Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Aerator | Local pet store | We use Whisper 60 | |
| Silicone tubing 1/8” | VWR | 408060-0030 | |
| 120° Y Connector | VWR | 82017-256 | |
| Quick disconnects | VWR | 46600-048 | |
| Plastic tube clamps | Bell-art products | 132250000 | Either this or next |
| Miniature Air Regulator | McMaster-Carr | 8727K11 | Either this or previous |
| Miniature Air Regulator Mounting Bracket | McMaster-Carr | 9891K66 | |
| Gilmont size 12 flow meter | VWR | 29895-242 | |
| Tool clips | McMaster-Carr | 1722A43 | To hold flow meters |
| Vial | VWR | 89092-722 | |
| Rubber stopper with two holes | VWR | 59585-186 | Fits in vials |
| 5 mm Pyrex Glass tubes | Trikinetics | PGT5x65 | Fits best in previous stopper. |
| Teflon tape | Hardware store | To achieve snug fit in stoppers if necessary | |
| Rubber stopper with two holes | VWR | 59582-122 | Fits our bottles |
| Disposable glass pipets | VWR | 53283-768 | Cut to length and bend by heating |
| Very fine nylon netting | VWR | Various | |
| 15 watt bulbs | Hardware store | Overhead red light | |
| Photographic red safe light filters | Overhead red light | ||
| Mini Flashlights with red filters | Mag-light |
References
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