Den flybar: Administrasjon Alkohol til Flies
Summary
Drosophila har dukket opp som en betydelig modellsystem for å dissekere de cellulære og molekylære grunnlaget for atferdsmessige reaksjoner til alkohol. Her presenterer vi en protokoll for innsamling av alkohol følsomhets data i en circadian kontekst som enkelt kan brukes til andre eksperimenter, og er godt egnet for lågare forskning.
Abstract
Fruktfluer (Drosophila melanogaster) er en etablert modell for både alkohol forskning og circadian biologi. Nylig viste vi at den biologiske klokke modulerer alkohol følsomhet, men ikke dannelsen av toleranse. Her beskriver vi vår protokoll i detalj. Alkohol administreres til fluene hjelp av Flybar. I dette oppsettet er mettet alkohol damp blandet med luftfuktighet i innstilte proporsjoner, og gis til de fluer i fire rør samtidig. Fluer er alet opp under standardiserte forhold for å minimere variasjon mellom replikatene. Tre dager gamle fluer av forskjellige genotyper eller behandlinger anvendes for eksperimentene, fortrinnsvis ved å matche fluer i to forskjellige tidspunkter (f.eks, CT 5 CT og 17) som gjør en direkte sammenligning er mulig. Under eksperimentet blir fluene eksponert i 1 time til den forhåndsbestemte andel av alkoholdamp og antallet fluer som utviser tap av opprettingsrefleks (LORR) eller sedasjon telles hver 5 min. Dataene kan analyseres ved hjelp av tre ulike statistiske tilnærminger. Den første er å bestemme tidspunktet for når 50% av fluene har mistet sin rettende refleks og bruke en analyse av variansen (ANOVA) for å avgjøre om signifikante forskjeller mellom tidspunkter. Den andre er å bestemme prosent fluer som viser Lorr etter et bestemt antall minutter, etterfulgt av en ANOVA analyse. Den siste metode er å analysere hele tiden serie ved hjelp av multivariabel statistikk. Protokollen kan også benyttes til ikke-biologiske eksperimenter eller sammenligninger mellom genotypene.
Introduction
Drosophila melanogaster demonstrere bifasisk atferdsmessige reaksjoner på alkohol en som er analogt til menneskelige reaksjoner på dette stoffet 2,3. Ved førstegangs eksponering for lave konsentrasjoner av alkohol, flyr utstilling økt muskelaktivitet, erstattet av en mangel på motorisk koordinasjon, tap av postural kontroll og rettende reflekser (tap av stabiliserings Reflex: Lorr), og sedasjon (fullstendig mangel på motorisk aktivitet i respons til mekanisk stimulering) som eksponering for alkohol utvikler 4-9. Den endogene biologiske klokke er en sterk modulator av alkohol følsomhet og toksisitet som observeres hos mus 10,11, rotter 12 og 13 mennesker. Nylige fremskritt i Drosophila forskning har vist den biologiske klokke modulerer akutt alkoholfølsomhet, men ikke alkohol toleranse en. De kraftige genetiske metoder tilgjengelige i Drosophila gjennom mutant studier og transgene manipulasjoner av romligog timelig genuttrykk gi et system som tillater rask fremgang i å identifisere de underliggende cellulære og molekylære mekanismer for komplekse atferd. Bruken av Drosophila som en unders verktøyet har tillatt vesentlige fremskritt i forståelsen av alkohol neurobiology som raskt kan oversettes til pattedyr 14-16. For å lette forståelsen av den molekylære mekanismene gjennom hvilke den biologiske klokke modulerer alkohol følsomhet og for jevnt å måle atferdsmessige respons på tvers av cirkadianske tidspunkter, en alkohol administrasjonsprotokollen er egnet for bruk i svakt rødt lys er nødvendig. For Drosophila, kan alkohol administreres gjennom mat-tilskudd for kronisk eksponering eller en pålitelig måte ved administrering av alkohol i form av damp for akutt eksponering. Her beskriver vi en alkohol administrasjon protokoll egnet for vurdering av den biologiske modulering av Tap av opprettingsrefleks (Lorr) 1 samtsedasjon.
Fluer medføres med 12 t: 12 t LD sykluser ved konstant temperatur, og deretter overført til en kontrollert lysregime i 2-5 dager, avhengig av den eksperimentelle spørsmålet. Fluer er utsatt for etanoldamp i en anordning kjent som Flybar. Ved denne anordning, blir kontrollerte mengder luft boblet gjennom vann og alkohol; dampene blir deretter blandet og ledet inn i en ampulle huset fluene. Hver 5 min fluene er scoret for antall som ikke klarer å vise rettende reflekser eller har blitt bedøvet. Lorr prosenter for hvert tidspunkt er beregnet og sammenlignet blant circadian tidspunkter eller mellom stammer av fluer. Enkelheten og påliteligheten av alkohol levering bruker flybar alkohol levering kombinert med atferdsanalysemuligheter gir en betydelig fordel for biologiske eksperimenter utført i mørke omgivelser.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kostnadene ved alkoholmisbruk og alkoholisme for samfunnet er enorm, både i form av menneske 29 og økonomiske kostnader 30,31. Drosophila som modell tilbyr en rask og allsidig system for raskt å undersøke atferdsmessige reaksjoner av et stort antall individer og som sådan har vært mye brukt for både alkohol 5,7,32-34 og circadian forskning 35-37.
Her beskrev vi en grei protokoll for kontrollert inntak av alkohol damp til voksne flue…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Finansiering for denne forskningen ble gitt av et program i Neuroscience Award fra Florida State University College of Medicine og støtte fra Institutt for biologisk vitenskap på FSU. Ytterligere finansiering ble gitt av en Grant-i-Aid fra alkohol Beverage Produsentens forskningsfond.
Materials
| Alcohol 190 proof | Various | ||
| Name of Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Aerator | Local pet store | We use Whisper 60 | |
| Silicone tubing 1/8” | VWR | 408060-0030 | |
| 120° Y Connector | VWR | 82017-256 | |
| Quick disconnects | VWR | 46600-048 | |
| Plastic tube clamps | Bell-art products | 132250000 | Either this or next |
| Miniature Air Regulator | McMaster-Carr | 8727K11 | Either this or previous |
| Miniature Air Regulator Mounting Bracket | McMaster-Carr | 9891K66 | |
| Gilmont size 12 flow meter | VWR | 29895-242 | |
| Tool clips | McMaster-Carr | 1722A43 | To hold flow meters |
| Vial | VWR | 89092-722 | |
| Rubber stopper with two holes | VWR | 59585-186 | Fits in vials |
| 5 mm Pyrex Glass tubes | Trikinetics | PGT5x65 | Fits best in previous stopper. |
| Teflon tape | Hardware store | To achieve snug fit in stoppers if necessary | |
| Rubber stopper with two holes | VWR | 59582-122 | Fits our bottles |
| Disposable glass pipets | VWR | 53283-768 | Cut to length and bend by heating |
| Very fine nylon netting | VWR | Various | |
| 15 watt bulbs | Hardware store | Overhead red light | |
| Photographic red safe light filters | Overhead red light | ||
| Mini Flashlights with red filters | Mag-light |
References
- Linde, K., Lyons, L. C. Circadian modulation of acute alcohol sensitivity but not acute tolerance in Drosophila. Chronobiol. Int. 28, 397-406 (2011).
- Kaun, K. R., Azanchi, R., Maung, Z., Hirsh, J., Heberlein, U. A Drosophila model for alcohol reward. Nat Neurosci. 14, 612-619 (2011).
- Shohat-Ophir, G., Kaun, K. R., Azanchi, R., Mohammed, H., Heberlein, U. Sexual deprivation increases ethanol intake in Drosophila. Science. 335, 1351-1355 (2012).
- Bellen, H. J. The fruit fly: A model organism to study the genetics of alcohol abuse and addiction. Cell. 93, 909-912 (1998).
- Guarnieri, D. J., Heberlein, U. Drosophila melanogaster, a genetic model system for alcohol research. International Review of Neurobiology. 54, 203-232 (2003).
- Scholz, H. Intoxicated fly brains: Neurons mediating ethanol-induced behaviors. J. Neurogenet. 23, 111-119 (2009).
- Wolf, F. W., Rodan, A. R., Tsai, L. T. Y., Heberlein, U. High-resolution analysis of ethanol-induced locomotor stimulation in Drosophila. J. Neurosci. 22, 11035-11044 (2002).
- Schumann, G., Spanagel, R., Mann, K. Candidate genes for alcohol dependence: Animal studies. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 27, 880-888 (2003).
- Singh, C. M., Heberlein, U. Genetic control of acute ethanol-induced behaviors in Drosophila. Alcohol Clin Exp Res. 24, 1127-1136 (2000).
- Perreau-Lenz, S., Zghoul, T., de Fonseca, F. R., Spanagel, R., Bilbao, A. Circadian regulation of central ethanol sensitivity by the mPer2 gene. Addiction Biology. 14, 253-259 (2009).
- Brager, A. J., Prosser, R. A., Glass, J. D. Circadian and acamprosate modulation of elevated ethanol drinking in mPer2 clock gene mutant mice. Chronobiol. Int. 28, 664-672 (2011).
- Sinclair, J. D., Geller, I. Ethanol consumption by rats under different lighting conditions. Science. 175, 1143-1144 (1972).
- Danel, T., Jeanson, R., Touitou, Y. Temporal pattern in consumption of the first drink of the day in alcohol-dependent persons. Chronobiol. Int. 20, 1093-1102 (2003).
- Kapfhamer, D., et al. Taok2 controls behavioral response to ethanol in mice. Genes, brain, and behavior. 12 (1), 87-97 (2012).
- Lasek, A. W., et al. An evolutionary conserved role for anaplastic lymphoma kinase in behavioral responses to ethanol. PLoS One. 6, 226-236 (2011).
- Lasek, A. W., Giorgetti, F., Berger, K. H., Tayor, S., Heberlein, U. Lmo genes regulate behavioral responses to ethanol in Drosophila melanogaster and the mouse. Alcohol Clin Exp Res. 35, 1600-1606 (2011).
- Lyons, L. C., Roman, G. Circadian modulation of short-term memory in Drosophila. Learning & Memory. 16, 19-27 (2009).
- Hamblen-Coyle, M. J., Wheeler, D. A., Rutila, J. E., Rosbash, M., Hall, J. C. Behavior of period-altered circadian-rhythm mutants of Drosophila in ligh-dark cycles (Diptera Drosophilidae). J. Insect Behav. 5, 417-446 (1992).
- Konopka, R. J., Pittendrigh, C., Orr, D. Reciprocal behavior associated with altered homeostasis and photosensitivity of Drosophila clock mutants. J. Neurogenet. 6, 1-10 (1989).
- Power, J. M., Ringo, J. M., Dowse, H. B. The effects of period mutations and light on the activity rhythms of Drosophila melanogaster. Journal of Biological Rhythms. 10, 267-280 (1995).
- Yoshii, T., et al. Temperature cycles drive Drosophila circadian oscillation in constant light that otherwise induces behavioural arrhythmicity. Eur. J. Neurosci. 22, 1176-1184 (2005).
- Berger, K. H., Heberlein, U., Moore, M. S. Rapid and chronic: two distinct forms of ethanol tolerance in Drosophila. Alcohol Clin Exp Res. 28, 1469-1480 (2004).
- Scholz, H., Ramond, J., Singh, C. M., Heberlein, U. Functional ethanol tolerance in Drosophila. Neuron. 28, 261-271 (2000).
- Kong, E. C., et al. Ethanol-regulated genes that contribute to ethanol sensitivity and rapid tolerance in Drosophila. Alcohol Clin Exp Res. 34, 302-316 (2010).
- Borycz, J., Borycz, J., Kubow, A., Lloyd, V., Meinertzhagen, I. Drosophila ABC transporter mutants white, brown and scarlet have altered contents and distribution of biogenic amines in the brain. J. Exp. Biol. 211, 3454-3466 (2008).
- Sitaraman, D., et al. Serotonin is necessary for place memory in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 5579-5584 (2008).
- Bainton, R. J., et al. Dopamine modulates acute responses to cocaine, nicotine and ethanol in Drosophila. Current Biology. 10, 187-194 (2000).
- Kong, E. C., et al. A pair of dopamine neurons target the D1-like dopamine receptor DopR in the central complex to promote ethanol-stimulated locomotion in Drosophila. Plos One. 5, (2010).
- Xu, J., Kochanek, K. D., Murphy, S. L., Tejada-Vera, B. . Deaths: Final data for 2007. , (2010).
- . The National Center on Addiction and Substance Abuse. Shoveling up II: The impact of substance abuse on federal, state and local budgets. , (2009).
- NIAAA, Estimated economic costs of alcohol abuse in the United States. , (1992).
- Devineni, A. V., Heberlein, U. Preferential ethanol consumption in Drosophila models features of addiction. Current Biology. 19, 2126-2132 (2009).
- Devineni, A. V., Heberlein, U. Addiction-like behavior in Drosophila. Communicative & Integrative Biology. 3, 357-359 (2010).
- Rodan, A. R., Rothenfluh, A. The genetics of behavioral alcohol responses in Drosophila. International Review of Neurobiology. 91, 25-51 (2010).
- Boothroyd, C. E., Young, M. W., Pfaff, D. W., Kieffer, B. Molecular and Biophysical Mechanisms of Arousal, Alertness, and Attention. Annals of the New York Academy of Sciences. 1129, 350-357 (2008).
- Nitabach, M. N., Taghert, P. H. Organization of the Drosophila circadian control circuit. Current Biology. 18, 84-93 (2008).
- Sheeba, V. The Drosophila melanogaster circadian pacemaker circuit. J. Genet. 87, 485-493 (2008).
- Cohan, F. M., Graf, J. -. D. Latitudinal cline in Drosophila melanogaster for knockdown resistance to ethanol fumes and for rates of response to selection for further resistance. Evolution. , 278-293 (1985).
- Moore, M. S., et al. Ethanol intoxication in Drosophila: Genetic and pharmacological evidence for regulation by the cAMP signaling pathway. Cell. 93, 997-1007 (1998).
- Berger, K. H., et al. Ethanol sensitivity and tolerance in long-term memory mutants of Drosophila melanogaster. Alcohol Clin Exp Res. 32, 895-908 (2008).
- Pohl, J. B., et al. Circadian Genes Differentially Affect Tolerance to Ethanol. in Drosophila. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. , (2013).
- Bhandari, P., Kendler, K. S., Bettinger, J. C., Davies, A. G., Grotewiel, M. An assay for evoked locomotor behavior in Drosophila reveals a role for integrins in ethanol sensitivity and rapid ethanol tolerance. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 33, 1794-1805 (2009).
- Rothenfluh, A., et al. Distinct behavioral responses to ethanol are regulated by alternate RhoGAP18B isoforms. Cell. 127, (1016).
