Summary
Drosophila surgiu como um sistema modelo importante para dissecar as bases celulares e moleculares de respostas comportamentais ao álcool. Aqui é apresentado um protocolo para a recolha de dados de sensibilidade do álcool em um contexto circadiano que pode ser facilmente aplicado a outros ensaios e é bem adequada para a pesquisa de graduação.
Abstract
Moscas de frutas (Drosophila melanogaster) são um modelo estabelecido para a pesquisa de álcool e biologia circadiano. Recentemente, mostramos que o relógio circadiano modula sensibilidade ao álcool, mas não a formação de tolerância. Aqui, descrevemos nosso protocolo em detalhe. O álcool é administrado às moscas usando flybar. Nesta configuração, o vapor de álcool saturado é misturado com o ar umidificado em proporções definidas e administradas às moscas em quatro tubos simultaneamente. As moscas são criadas sob condições padronizadas, a fim de minimizar a variação entre as repetições. Três dias de idade moscas de diferentes genótipos ou tratamentos são utilizados para os experimentos, de preferência por moscas de dois pontos diferentes de tempo (por exemplo, CT 5 e CT 17) fazendo comparações diretas possível combinar. Durante a experiência, as moscas são expostos durante 1 hora a percentagem pré-determinada de vapor de álcool e o número de moscas que exibem a perda do reflexo de endireitamento (LORR) ou sedção são contados a cada 5 min. Os dados podem ser analisados utilizando-se três abordagens estatísticas diferentes. A primeira é a de determinar o tempo em que 50% das moscas têm perdido o reflexo de endireitamento e usar uma análise da variância (ANOVA) para determinar se existem diferenças significativas entre pontos de tempo. O segundo é o de determinar as moscas percentuais que mostram Lorr após um determinado número de minutos, seguido de uma análise ANOVA. O último método é analisar toda a série vezes utilizando estatística multivariada. O protocolo também pode ser usado para as experiências não circadianos ou comparações entre genótipos.
Introduction
Drosophila melanogaster demonstrar respostas comportamentais bifásicos ao álcool 1, que são análogas às respostas humanas a este fármaco 2,3. Após a exposição inicial a baixas concentrações de álcool, moscas apresentam aumento da atividade locomotora, substituído por uma falta de coordenação motora, a perda de controle postural e reflexos de endireitamento (perda do reflexo de endireitamento: Lorr) e sedação (completa falta de atividade motora em resposta a estimulação mecânica) como a exposição ao álcool progride 4-9. O relógio circadiano endógeno é um forte modulador de álcool sensibilidade e toxicidade, como observado em ratinhos, ratos 10,11 12, 13 e os seres humanos. Os recentes avanços na pesquisa Drosophila mostraram o relógio circadiano modula a sensibilidade aguda de álcool, mas não de álcool tolerância 1. As poderosas abordagens genéticas disponíveis em Drosophila através de estudos mutantes e manipulações transgênicas de espaciale expressão gênica temporal, fornecer um sistema que permite um progresso rápido na identificação dos mecanismos celulares e moleculares subjacentes para comportamentos complexos. O uso de Drosophila como ferramenta de investigação tem permitido avanços substanciais na compreensão da neurobiologia de álcool que podem ser rapidamente convertidos em mamíferos 14-16. A fim de facilitar a compreensão dos mecanismos moleculares pelos quais o relógio circadiano modula a sensibilidade do álcool e para medir respostas comportamentais uniformemente em toda a pontos de tempo circadiano, um protocolo de administração do álcool apropriado para o uso em fracas condições de luz vermelha não é requerida. Para Drosophila, o álcool pode ser administrado por meio de suplementação alimentar para a exposição crônica ou de forma confiável através de administração de álcool na forma de vapor para exposições agudas. Aqui, descrevemos um protocolo de administração de álcool adequado para a avaliação da modulação circadiana da Loss-of-reflexo de endireitamento (Lorr) 1, bem comosedação.
As moscas são arrastadas com 12 horas: 12 horas LD ciclos a uma temperatura constante e, em seguida, transferida para um regime de luz controlada durante 2-5 dias, dependendo da questão experimental. As moscas são expostas a vapor de etanol, em um aparelho conhecido como o Flybar. Neste dispositivo, quantidades controladas de ar são borbulhar na água e álcool; Os vapores são então misturados e dirigido para uma caixa de frasco, as moscas. Cada 5 min as moscas são marcados para o número que não consegue exibir corrigir reflexos ou tornaram-se sedado. Percentagens Lorr para cada ponto de tempo é calculado e comparado entre os pontos de tempo circadianos ou entre estirpes de moscas. A simplicidade e confiabilidade do fornecimento de álcool com a entrega de álcool Flybar combinado com opções de análise de comportamento proporciona um benefício significativo para os experimentos realizados circadianos em ambientes escuros.
Protocol
Representative Results
Discussion
Os custos de abuso de álcool e alcoolismo para a sociedade é enorme, tanto em termos de custos humanos e econômicos 30,31 29. Drosophila como modelo oferece um sistema rápido e versátil para examinar rapidamente as respostas comportamentais de um grande número de indivíduos e, como tal, tem sido amplamente utilizado tanto para álcool 5,7,32-34 e pesquisa circadiano 35-37.
Aqui, descrevemos um protocolo simples para a administração controlad…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
O financiamento para esta pesquisa foi fornecido por um programa em Neurociências Prêmio da Florida State University College of Medicine e apoio do Departamento de Ciências Biológicas da FSU. Financiamento adicional foi fornecida por um Grant-in-Aid do Fundo de Investigação do Álcool Bebidas Fabricante.
Materials
| Alcohol 190 proof | Various | ||
| Name of Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Aerator | Local pet store | We use Whisper 60 | |
| Silicone tubing 1/8” | VWR | 408060-0030 | |
| 120° Y Connector | VWR | 82017-256 | |
| Quick disconnects | VWR | 46600-048 | |
| Plastic tube clamps | Bell-art products | 132250000 | Either this or next |
| Miniature Air Regulator | McMaster-Carr | 8727K11 | Either this or previous |
| Miniature Air Regulator Mounting Bracket | McMaster-Carr | 9891K66 | |
| Gilmont size 12 flow meter | VWR | 29895-242 | |
| Tool clips | McMaster-Carr | 1722A43 | To hold flow meters |
| Vial | VWR | 89092-722 | |
| Rubber stopper with two holes | VWR | 59585-186 | Fits in vials |
| 5 mm Pyrex Glass tubes | Trikinetics | PGT5x65 | Fits best in previous stopper. |
| Teflon tape | Hardware store | To achieve snug fit in stoppers if necessary | |
| Rubber stopper with two holes | VWR | 59582-122 | Fits our bottles |
| Disposable glass pipets | VWR | 53283-768 | Cut to length and bend by heating |
| Very fine nylon netting | VWR | Various | |
| 15 watt bulbs | Hardware store | Overhead red light | |
| Photographic red safe light filters | Overhead red light | ||
| Mini Flashlights with red filters | Mag-light |
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