Flybar: Администрирование Алкоголь в мух
Summary
Drosophila стала значительным модельной системы для рассечения клеточные и молекулярные основы поведенческих ответов на алкоголь. Здесь мы приводим протокол для сбора данных чувствительности алкоголя в циркадных контексте, который может быть с легкостью применить для других экспериментов и хорошо подходит для студентов исследований.
Abstract
Плодовые мушки (дрозофилы) являемся известной модели как для исследования алкоголя и циркадных биологии. Недавно мы показали, что циркадные часы модулирует чувствительность алкоголя, но не формирование толерантности. Здесь мы описываем наш протокол подробно. Алкоголь вводят мух с использованием Flybar. В этой конфигурации, насыщенных паров алкоголя смешивается с увлажненным воздухом в заданных пропорциях, и вводили мух в одновременно четырех трубок. Мухи выращивают в стандартных условиях с целью минимизации Разница между повторами. Трехдневные старые мухи разных генотипов или лечения используются для экспериментов, предпочтительно путем сопоставления мух двух различных временных точках (например, КТ 5 и СТ 17) принятие возможно прямое сравнение. В ходе эксперимента мухи подвергаются в течение 1 часа в заранее определенном проценте парами спирта и количества мух, которые демонстрируют утрата установочного рефлекса (Lorr) или седAtion подсчитываются каждые 5 минут. Эти данные могут быть проанализированы с использованием трех различных статистических подходов. Во-первых, определить время, при которой 50% от мух потеряли свою рефлекса и использовать анализ дисперсии (ANOVA) для определения того, существуют ли значительные различия между моментами времени. Вторая заключается в определении процентных мух, которые показывают Lorr после определенного количества минут, а затем на основе анализа ANOVA. Последний метод является анализ временных рядов весь помощью многомерного статистического анализа. Протокол также может быть использован для не-циркадных экспериментов или сравнений между генотипами.
Introduction
Дрозофилы продемонстрировать двухфазные поведенческие реакции на алкоголь 1, аналогичные реакции человека на этот препарат 2,3. После первого воздействия низких концентраций алкоголя, мухи обладают повышенной двигательной активности, заменены отсутствия координации движений, потеря постурального контроля и восстанавливающих рефлексов (утрата установочного рефлекса: Lorr) и седации (полное отсутствие двигательной активности в ответ на механическое раздражение) как воздействие алкоголя прогрессирует 4-9. Эндогенный циркадные часы является сильным модулятор чувствительности алкоголя и токсичности как это наблюдается у мышей 10,11, крыс 12, и человека 13. Последние достижения в области исследований Drosophila показали циркадные часы модулирует острый чувствительность алкоголя, но не алкоголя терпимости 1. Мощные генетические подходы, доступные в дрозофилы через мутантных исследований и трансгенных манипуляций пространственныхи выражение временная ген обеспечить систему, которая позволяет быстро достичь успехов в выявлять основополагающие клеточные и молекулярные механизмы для сложных форм поведения. Использование Drosophila в качестве инструмента следственной позволило по существу успехи в понимании нейробиологии спирта, которые могут быть быстро переведены в млекопитающих 14-16. Для того чтобы облегчить понимание молекулярных механизмов, посредством которых циркадные часы модулирует чувствительность алкоголя и равномерно измерить поведенческие реакции через циркадных моменты времени, протокол администрирования алкоголя, подходящий для использования в условиях слабого освещения красный свет не требуется. Для дрозофилы, алкоголь можно вводить через пищевых добавок для хронического воздействия или надежно через администрирование алкоголь в виде пара для остром воздействии. Здесь мы описываем протокол администрирования алкоголь подходящий для оценки циркадного модуляции Потеря-рефлекса (Lorr) 1, а такжеседативный.
Мухи, увлекаются 12 часов: 12 циклов час LD при постоянной температуре, а затем переведен в контролируемой светового режима в течение 2-5 дней в зависимости от экспериментальной вопрос. Мухи подвергаются паров этанола в устройстве, известном как Flybar. В этом устройстве контролируемые количества воздуха пропускается через воду и спирт; пары затем смешивают и направляют в флаконе жилья мухи. Каждый 5 мин мух забил на номер, который не удается отобразить восстанавливающее рефлексы или стали отключке. Lorr проценты для каждой временной точки рассчитаны и сопоставлены среди циркадных моменты времени или между штаммами мух. Простота и надежность доставки алкоголя с помощью доставки Flybar алкоголя в сочетании с поведенческими возможностями подведения итогов обеспечивает значительное преимущество для циркадных экспериментов, проведенных в условиях низкой освещенности.
Protocol
Representative Results
Discussion
Расходы, связанные с злоупотреблением алкоголем и алкоголизма для общества огромен, как с точки зрения человека 29 и экономических издержек 30,31. Дрозофилы как модель предлагает быстрый и универсальную систему для быстрого изучения поведенческих реакций большого колич…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Финансирование для этого исследования была предоставлена Программы в неврологии премии от штата Флорида Университетского колледжа медицины и поддержке Департамента биологических наук в странах бывшего Советского Союза. Дополнительное финансирование было предоставлено за счет гранта-в-помощь от фонда исследований напитка алкоголя производителя.
Materials
| Alcohol 190 proof | Various | ||
| Name of Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Aerator | Local pet store | We use Whisper 60 | |
| Silicone tubing 1/8” | VWR | 408060-0030 | |
| 120° Y Connector | VWR | 82017-256 | |
| Quick disconnects | VWR | 46600-048 | |
| Plastic tube clamps | Bell-art products | 132250000 | Either this or next |
| Miniature Air Regulator | McMaster-Carr | 8727K11 | Either this or previous |
| Miniature Air Regulator Mounting Bracket | McMaster-Carr | 9891K66 | |
| Gilmont size 12 flow meter | VWR | 29895-242 | |
| Tool clips | McMaster-Carr | 1722A43 | To hold flow meters |
| Vial | VWR | 89092-722 | |
| Rubber stopper with two holes | VWR | 59585-186 | Fits in vials |
| 5 mm Pyrex Glass tubes | Trikinetics | PGT5x65 | Fits best in previous stopper. |
| Teflon tape | Hardware store | To achieve snug fit in stoppers if necessary | |
| Rubber stopper with two holes | VWR | 59582-122 | Fits our bottles |
| Disposable glass pipets | VWR | 53283-768 | Cut to length and bend by heating |
| Very fine nylon netting | VWR | Various | |
| 15 watt bulbs | Hardware store | Overhead red light | |
| Photographic red safe light filters | Overhead red light | ||
| Mini Flashlights with red filters | Mag-light |
References
- Linde, K., Lyons, L. C. Circadian modulation of acute alcohol sensitivity but not acute tolerance in Drosophila. Chronobiol. Int. 28, 397-406 (2011).
- Kaun, K. R., Azanchi, R., Maung, Z., Hirsh, J., Heberlein, U. A Drosophila model for alcohol reward. Nat Neurosci. 14, 612-619 (2011).
- Shohat-Ophir, G., Kaun, K. R., Azanchi, R., Mohammed, H., Heberlein, U. Sexual deprivation increases ethanol intake in Drosophila. Science. 335, 1351-1355 (2012).
- Bellen, H. J. The fruit fly: A model organism to study the genetics of alcohol abuse and addiction. Cell. 93, 909-912 (1998).
- Guarnieri, D. J., Heberlein, U. Drosophila melanogaster, a genetic model system for alcohol research. International Review of Neurobiology. 54, 203-232 (2003).
- Scholz, H. Intoxicated fly brains: Neurons mediating ethanol-induced behaviors. J. Neurogenet. 23, 111-119 (2009).
- Wolf, F. W., Rodan, A. R., Tsai, L. T. Y., Heberlein, U. High-resolution analysis of ethanol-induced locomotor stimulation in Drosophila. J. Neurosci. 22, 11035-11044 (2002).
- Schumann, G., Spanagel, R., Mann, K. Candidate genes for alcohol dependence: Animal studies. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 27, 880-888 (2003).
- Singh, C. M., Heberlein, U. Genetic control of acute ethanol-induced behaviors in Drosophila. Alcohol Clin Exp Res. 24, 1127-1136 (2000).
- Perreau-Lenz, S., Zghoul, T., de Fonseca, F. R., Spanagel, R., Bilbao, A. Circadian regulation of central ethanol sensitivity by the mPer2 gene. Addiction Biology. 14, 253-259 (2009).
- Brager, A. J., Prosser, R. A., Glass, J. D. Circadian and acamprosate modulation of elevated ethanol drinking in mPer2 clock gene mutant mice. Chronobiol. Int. 28, 664-672 (2011).
- Sinclair, J. D., Geller, I. Ethanol consumption by rats under different lighting conditions. Science. 175, 1143-1144 (1972).
- Danel, T., Jeanson, R., Touitou, Y. Temporal pattern in consumption of the first drink of the day in alcohol-dependent persons. Chronobiol. Int. 20, 1093-1102 (2003).
- Kapfhamer, D., et al. Taok2 controls behavioral response to ethanol in mice. Genes, brain, and behavior. 12 (1), 87-97 (2012).
- Lasek, A. W., et al. An evolutionary conserved role for anaplastic lymphoma kinase in behavioral responses to ethanol. PLoS One. 6, 226-236 (2011).
- Lasek, A. W., Giorgetti, F., Berger, K. H., Tayor, S., Heberlein, U. Lmo genes regulate behavioral responses to ethanol in Drosophila melanogaster and the mouse. Alcohol Clin Exp Res. 35, 1600-1606 (2011).
- Lyons, L. C., Roman, G. Circadian modulation of short-term memory in Drosophila. Learning & Memory. 16, 19-27 (2009).
- Hamblen-Coyle, M. J., Wheeler, D. A., Rutila, J. E., Rosbash, M., Hall, J. C. Behavior of period-altered circadian-rhythm mutants of Drosophila in ligh-dark cycles (Diptera Drosophilidae). J. Insect Behav. 5, 417-446 (1992).
- Konopka, R. J., Pittendrigh, C., Orr, D. Reciprocal behavior associated with altered homeostasis and photosensitivity of Drosophila clock mutants. J. Neurogenet. 6, 1-10 (1989).
- Power, J. M., Ringo, J. M., Dowse, H. B. The effects of period mutations and light on the activity rhythms of Drosophila melanogaster. Journal of Biological Rhythms. 10, 267-280 (1995).
- Yoshii, T., et al. Temperature cycles drive Drosophila circadian oscillation in constant light that otherwise induces behavioural arrhythmicity. Eur. J. Neurosci. 22, 1176-1184 (2005).
- Berger, K. H., Heberlein, U., Moore, M. S. Rapid and chronic: two distinct forms of ethanol tolerance in Drosophila. Alcohol Clin Exp Res. 28, 1469-1480 (2004).
- Scholz, H., Ramond, J., Singh, C. M., Heberlein, U. Functional ethanol tolerance in Drosophila. Neuron. 28, 261-271 (2000).
- Kong, E. C., et al. Ethanol-regulated genes that contribute to ethanol sensitivity and rapid tolerance in Drosophila. Alcohol Clin Exp Res. 34, 302-316 (2010).
- Borycz, J., Borycz, J., Kubow, A., Lloyd, V., Meinertzhagen, I. Drosophila ABC transporter mutants white, brown and scarlet have altered contents and distribution of biogenic amines in the brain. J. Exp. Biol. 211, 3454-3466 (2008).
- Sitaraman, D., et al. Serotonin is necessary for place memory in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 5579-5584 (2008).
- Bainton, R. J., et al. Dopamine modulates acute responses to cocaine, nicotine and ethanol in Drosophila. Current Biology. 10, 187-194 (2000).
- Kong, E. C., et al. A pair of dopamine neurons target the D1-like dopamine receptor DopR in the central complex to promote ethanol-stimulated locomotion in Drosophila. Plos One. 5, (2010).
- Xu, J., Kochanek, K. D., Murphy, S. L., Tejada-Vera, B. . Deaths: Final data for 2007. , (2010).
- . The National Center on Addiction and Substance Abuse. Shoveling up II: The impact of substance abuse on federal, state and local budgets. , (2009).
- NIAAA, Estimated economic costs of alcohol abuse in the United States. , (1992).
- Devineni, A. V., Heberlein, U. Preferential ethanol consumption in Drosophila models features of addiction. Current Biology. 19, 2126-2132 (2009).
- Devineni, A. V., Heberlein, U. Addiction-like behavior in Drosophila. Communicative & Integrative Biology. 3, 357-359 (2010).
- Rodan, A. R., Rothenfluh, A. The genetics of behavioral alcohol responses in Drosophila. International Review of Neurobiology. 91, 25-51 (2010).
- Boothroyd, C. E., Young, M. W., Pfaff, D. W., Kieffer, B. Molecular and Biophysical Mechanisms of Arousal, Alertness, and Attention. Annals of the New York Academy of Sciences. 1129, 350-357 (2008).
- Nitabach, M. N., Taghert, P. H. Organization of the Drosophila circadian control circuit. Current Biology. 18, 84-93 (2008).
- Sheeba, V. The Drosophila melanogaster circadian pacemaker circuit. J. Genet. 87, 485-493 (2008).
- Cohan, F. M., Graf, J. -. D. Latitudinal cline in Drosophila melanogaster for knockdown resistance to ethanol fumes and for rates of response to selection for further resistance. Evolution. , 278-293 (1985).
- Moore, M. S., et al. Ethanol intoxication in Drosophila: Genetic and pharmacological evidence for regulation by the cAMP signaling pathway. Cell. 93, 997-1007 (1998).
- Berger, K. H., et al. Ethanol sensitivity and tolerance in long-term memory mutants of Drosophila melanogaster. Alcohol Clin Exp Res. 32, 895-908 (2008).
- Pohl, J. B., et al. Circadian Genes Differentially Affect Tolerance to Ethanol. in Drosophila. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. , (2013).
- Bhandari, P., Kendler, K. S., Bettinger, J. C., Davies, A. G., Grotewiel, M. An assay for evoked locomotor behavior in Drosophila reveals a role for integrins in ethanol sensitivity and rapid ethanol tolerance. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 33, 1794-1805 (2009).
- Rothenfluh, A., et al. Distinct behavioral responses to ethanol are regulated by alternate RhoGAP18B isoforms. Cell. 127, (1016).
