Summary

La barra estabilizadora: Administración de Alcohol para moscas

Published: May 18, 2014
doi:

Summary

Drosophila ha surgido como un sistema modelo significativo para la disección de las bases celulares y moleculares de las respuestas de comportamiento al alcohol. Aquí se presenta un protocolo para la recogida de datos de sensibilidad de alcohol en un contexto circadiano que se puede aplicar fácilmente a otros experimentos y es muy adecuado para la investigación de pregrado.

Abstract

Moscas de la fruta (Drosophila melanogaster) son un modelo establecido para la investigación del alcohol y de la biología circadiana. Recientemente, se demostró que el reloj circadiano modula la sensibilidad al alcohol, pero no la formación de la tolerancia. Aquí se describe el protocolo en detalle. El alcohol se administró a las moscas usando la barra estabilizadora. En esta configuración, el vapor de alcohol saturado que se mezcla con aire humidificado en proporciones fijas, y se administró a las moscas en cuatro tubos de forma simultánea. Las moscas se crían en condiciones estandarizadas con el fin de minimizar la variación entre las repeticiones. Tres días de edad moscas de diferentes genotipos o tratamientos se utilizan para los experimentos, de preferencia, haciendo coincidir las moscas de dos puntos diferentes de tiempo (por ejemplo, CT 5 y CT 17) hacer comparaciones directas posible. Durante el experimento, las moscas están expuestos durante 1 hora con el porcentaje predeterminado de vapor de alcohol y el número de moscas que exhiben la pérdida del reflejo de enderezamiento (Lorr) o sedción se contabilizan cada 5 min. Los datos se pueden analizar usando tres enfoques estadísticos diferentes. La primera consiste en determinar el momento en el que el 50% de las moscas han perdido su reflejo de enderezamiento y utilizar un análisis de la varianza (ANOVA) para determinar si existen diferencias significativas entre los momentos. La segunda es determinar las moscas porcentuales que muestran Lorr después de un número especificado de minutos, seguido de un análisis de ANOVA. El último método es el de analizar la serie entera veces utilizando estadística multivariante. El protocolo también se puede utilizar para experimentos no circadianos o comparaciones entre los genotipos.

Introduction

Drosophila melanogaster demuestran las respuestas conductuales bifásicos al alcohol 1 que son análogas a las respuestas humanas a este fármaco 2,3. Tras la exposición inicial a bajas concentraciones de alcohol, moscas exhiben mayor actividad locomotriz, sustituida por una falta de coordinación motora, la pérdida del control postural y corregir reflejos (pérdida del reflejo: Lorr) y sedación (falta completa de la actividad motora en respuesta a la estimulación mecánica) como la exposición al alcohol progresa 4-9. El reloj circadiano endógeno es un fuerte modulador de la sensibilidad al alcohol y la toxicidad como se ha observado en ratones, ratas 10,11 12, y los seres humanos 13. Los recientes avances en la investigación de Drosophila han demostrado que el reloj circadiano modula la sensibilidad de alcohol aguda, pero no alcohol tolerancia 1. Los poderosos enfoques genéticos disponibles en Drosophila mutantes a través de estudios y manipulaciones transgénicas de espacialy temporal de la expresión génica proporciona un sistema que permite un rápido avance en la identificación de los mecanismos celulares y moleculares subyacentes a los comportamientos complejos. El uso de Drosophila como herramienta de investigación ha permitido avances sustanciales en la comprensión de la neurobiología del alcohol que se pueden traducir rápidamente a los mamíferos 14-16. Con el fin de facilitar la comprensión de los mecanismos moleculares a través de la que el reloj circadiano modula la sensibilidad al alcohol y para medir de manera uniforme las respuestas de comportamiento a través de puntos de tiempo circadianos, un protocolo de administración de alcohol adecuada para su uso en condiciones de luz roja tenue se requiere. Para Drosophila, el alcohol puede ser administrado a través de la suplementación de alimentos para la exposición crónica o de forma fiable a través de la administración de alcohol en forma de vapor para las exposiciones agudas. Aquí se describe un protocolo de administración de alcohol adecuado para la evaluación de la modulación circadiana de la pérdida de los reflejos de recuperación (Lorr) 1, así comosedación.

Las moscas son arrastradas con 12 hr: 12 hr LD ciclos a temperatura constante y luego transferidos a un régimen de luz controlada durante 2-5 días, dependiendo de la pregunta experimental. Las moscas se expusieron a vapor de etanol en un dispositivo conocido como la barra estabilizadora. En este dispositivo, cantidades controladas de aire se burbujeado a través de agua y alcohol; los vapores se mezclan entonces y se dirigen en una carcasa vial de las moscas. Cada 5 minutos, las moscas se califican para el número que no puede mostrar corregir reflejos o se han convertido en sedado. LORR porcentajes para cada punto de tiempo se calculan y se comparan entre puntos de tiempo circadianos o entre cepas de moscas. La simplicidad y la confiabilidad de la entrega de alcohol mediante el suministro de alcohol Flybar combinado con opciones de análisis de comportamiento proporciona un beneficio significativo para los experimentos circadianos realizados en condiciones oscuras.

Protocol

1. Montaje de la barra estabilizadora Justificación y visión: El sistema está diseñado para administrar porcentajes controladas de vapor de alcohol a las moscas. Nota: La figura 1 presenta una visión esquemática de la barra estabilizadora puesta a punto, como se describe a continuación en tres etapas (montaje del flujo de aire, la configuración del alcohol y las botellas de agua, y el montaje de los viales de observación). En definitiva, un flujo de aire constante se …

Representative Results

Modulación circadiano de alcohol de sensibilidad usando la LORR 50% como marcador. Un ejemplo representativo que muestra la modulación circadiano en la sensibilidad de alcohol durante el día se presenta en la Figura 2. LORR se midió a los seis puntos de tiempo durante el 2 º día de DD en Canton-S y el 50% LORR se determinó para cada punto de tiempo. El análisis mostró un efecto significativo de la hora del día (ANOVA: F 5,45 = 7,39, p…

Discussion

Los costos del abuso de alcohol y alcoholismo para la sociedad es enorme, tanto en términos de costos humanos y económicos 29 30,31. Drosophila como modelo ofrece un sistema rápido y versátil de examinar rápidamente las respuestas de comportamiento de un gran número de personas y, como tal, se ha utilizado ampliamente para tanto el alcohol 5,7,32-34 y la investigación circadiano 35-37.

Aquí, describimos un protocolo sencillo para la administr…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

El financiamiento para esta investigación fue proporcionado por el Programa de Premio de Neurociencia de la Universidad de Florida State College de Medicina y el apoyo del Departamento de Ciencias Biológicas de la FSU. Financiación adicional fue proporcionado por una subvención-en-Ayudas del Fondo de Investigación del Alcohol Beverage Fabricante.

Materials

Alcohol 190 proof Various
Name of Material Company Catalog Number Comments
Aerator Local pet store We use Whisper 60
Silicone tubing 1/8” VWR 408060-0030
120° Y Connector VWR 82017-256
Quick disconnects VWR 46600-048
Plastic tube clamps Bell-art products 132250000 Either this or next
Miniature Air Regulator McMaster-Carr 8727K11 Either this or previous
Miniature Air Regulator Mounting Bracket McMaster-Carr 9891K66
Gilmont size 12 flow meter VWR 29895-242
Tool clips McMaster-Carr 1722A43 To hold flow meters
Vial VWR 89092-722
Rubber stopper with two holes VWR 59585-186 Fits in vials
5 mm Pyrex Glass tubes Trikinetics PGT5x65 Fits best in previous stopper.
Teflon tape Hardware store To achieve snug fit in stoppers if necessary
Rubber stopper with two holes VWR 59582-122 Fits our bottles
Disposable glass pipets VWR 53283-768 Cut to length and bend by heating
Very fine nylon netting VWR Various
15 watt bulbs Hardware store Overhead red light
Photographic red safe light filters Overhead red light
Mini Flashlights with red filters Mag-light

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Citer Cet Article
van der Linde, K., Fumagalli, E., Roman, G., Lyons, L. C. The FlyBar: Administering Alcohol to Flies. J. Vis. Exp. (87), e50442, doi:10.3791/50442 (2014).

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