Den Flybar: Administrera alkohol till Flugor
Summary
Drosophila har vuxit fram som en betydande modellsystem för att dissekera de cellulära och molekylära grunderna för beteendemässiga reaktioner på alkohol. Här presenterar vi ett protokoll för insamling av alkohol känslighetsdata i en dygnsrytm sammanhang som enkelt kan tillämpas på andra experiment och är väl lämpad för grundutbildningen forskning.
Abstract
Fruktflugor (Drosophila melanogaster) är en etablerad modell för både alkohol forskning och dygnsrytm biologi. Nyligen visade vi att den dygnsrytm klocka modulerar alkoholkänslighet, men inte bildandet av tolerans. Här beskriver vi våra protokoll i detalj. Alkohol administreras till flugorna använder Flybar. Med den här inställningen är mättad alkoholånga blandad med fuktad luft i bestämda proportioner, och administreras till flugorna i fyra rör samtidigt. Flugor föds upp under standardiserade förhållanden för att minimera variation mellan replikat. Tre dagar gamla flugor av olika genotyper eller behandlingar används för experimenten, företrädesvis genom att matcha flugor av två olika tidpunkter (t.ex. CT-5-och CT-17) gör en direkt jämförelse möjlig. Under experimentet är flugor utsatta i 1 timme till den förutbestämd andel av alkoholånga och antalet flugor som uppvisar förlust av upprätningsreflex (LORR) eller sedation mäts varje 5 min. Data kan analyseras med användning av tre olika statistiska metoder. Den första är att bestämma den tid vid vilken 50% av flugorna har förlorat sin rätande reflex och använda en analys av variansen (ANOVA) för att avgöra om det finns betydande skillnader mellan tidpunkter. Den andra är att fastställa de procentuella flugor som visar LORR efter ett visst antal minuter, följt av en ANOVA-analys. Den sista metoden är att analysera hela tider serien med hjälp av multivariat statistik. Protokollet kan också användas för icke-dygnsrytm experiment eller jämförelser mellan genotyper.
Introduction
Drosophila melanogaster visar bifasisk beteendemässiga reaktioner på alkohol 1 som är analoga med mänskliga reaktioner på denna drog 2,3. Vid första exponering för låga koncentrationer av alkohol, flugor uppvisar ökad rörelseaktivitet, ersatts av en bristande samordning motor, förlust av postural kontroll och rätande reflexer (Förlust av upprätningsreflex: LORR), och sedering (total brist på motorisk aktivitet som svar mekanisk stimulering) som exponering för alkohol skrider 4-9. Den endogena dygnsrytm klocka är en stark modulator av alkoholkänslighet och toxicitet som observerats hos möss 10,11, råttor 12, och människor 13. Senaste framstegen inom Drosophila forskning har visat den dygnsrytm klocka modulerar akut alkoholkänslighet men inte alkoholtolerans 1. De kraftfulla genetiska metoder som finns i Drosophila genom mutant studier och transgena manipulationer av rumsligaoch tidsmässiga genuttryck ger ett system som gör att snabba framsteg i att identifiera de bakomliggande cellulära och molekylära mekanismer för komplexa beteenden. Användningen av Drosophila som en undersökande verktyg har möjliggjort väsentliga framsteg i att förstå alkohol neurobiologi som snabbt kan översättas till däggdjur 14-16. För att underlätta förståelsen av de molekylära mekanismer genom vilka den dygnsrytm klocka modulerar alkoholkänslighet och jämnt mäta beteendemässiga reaktioner över dygnsrytm tidpunkter, en alkoholadministrationsprotokoll som lämpar sig för användning i svagt rött ljus krävs. För Drosophila, kan alkohol ges via mat tillskott för kronisk exponering eller tillförlitligt genom att administrera alkohol i form av ånga för akut exponering. Här beskriver vi en alkoholadministrationsprotokoll som lämpar sig för bedömning av dygnsrytm modulering av förlust-av-upprätningsreflex (LORR) 1 samtsedering.
Flugor medföres med 12 tim: 12 tim LD cykler vid konstant temperatur och sedan överföras till en kontrollerad ljus ordning för 2-5 dagar beroende på den experimentella frågan. Flugor utsätts för etanolånga i en anordning känd som Flybar. I denna anordning är kontrollerade mängder luft bubblas genom vatten och alkohol; ångorna blandas sedan och riktas in i en ampull hölje flugor. Varje 5 min flugorna poängsätts för det antal som misslyckas med att visa rätande reflexer eller har blivit drogad. LORR procentsatser för varje tidpunkt beräknas och jämförs bland dygnsrytm tidpunkter eller mellan stammar av flugor. Enkelheten och tillförlitligheten i alkoholleverans med hjälp av Flybar alkohol leverans i kombination med beteendeanalysalternativ ger en signifikant fördel för dygnsrytm experiment som utförts under mörka förhållanden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kostnaderna för alkoholmissbruk och alkoholism för samhället är enorma, både i fråga om mänskliga 29 och ekonomiska kostnader 30,31. Drosophila som modell erbjuder ett snabbt och mångsidigt system för att snabbt undersöka beteendemässiga svar på ett stort antal individer och som sådan har i stor utsträckning använts för både alkohol 5,7,32-34 och dygnsrytm forskning 35-37.
Här beskrev vi en okomplicerad protokoll för kon…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Finansieringen för denna forskning gs av ett program i neurovetenskap Award från Florida State University College of Medicine och stöd från institutionen för biologisk vetenskap vid FSU. Ytterligare Finansieringen kom från en Grant-i-Stöd från alkohol drycker Tillverkarens forskningsfonden.
Materials
| Alcohol 190 proof | Various | ||
| Name of Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Aerator | Local pet store | We use Whisper 60 | |
| Silicone tubing 1/8” | VWR | 408060-0030 | |
| 120° Y Connector | VWR | 82017-256 | |
| Quick disconnects | VWR | 46600-048 | |
| Plastic tube clamps | Bell-art products | 132250000 | Either this or next |
| Miniature Air Regulator | McMaster-Carr | 8727K11 | Either this or previous |
| Miniature Air Regulator Mounting Bracket | McMaster-Carr | 9891K66 | |
| Gilmont size 12 flow meter | VWR | 29895-242 | |
| Tool clips | McMaster-Carr | 1722A43 | To hold flow meters |
| Vial | VWR | 89092-722 | |
| Rubber stopper with two holes | VWR | 59585-186 | Fits in vials |
| 5 mm Pyrex Glass tubes | Trikinetics | PGT5x65 | Fits best in previous stopper. |
| Teflon tape | Hardware store | To achieve snug fit in stoppers if necessary | |
| Rubber stopper with two holes | VWR | 59582-122 | Fits our bottles |
| Disposable glass pipets | VWR | 53283-768 | Cut to length and bend by heating |
| Very fine nylon netting | VWR | Various | |
| 15 watt bulbs | Hardware store | Overhead red light | |
| Photographic red safe light filters | Overhead red light | ||
| Mini Flashlights with red filters | Mag-light |
References
- Linde, K., Lyons, L. C. Circadian modulation of acute alcohol sensitivity but not acute tolerance in Drosophila. Chronobiol. Int. 28, 397-406 (2011).
- Kaun, K. R., Azanchi, R., Maung, Z., Hirsh, J., Heberlein, U. A Drosophila model for alcohol reward. Nat Neurosci. 14, 612-619 (2011).
- Shohat-Ophir, G., Kaun, K. R., Azanchi, R., Mohammed, H., Heberlein, U. Sexual deprivation increases ethanol intake in Drosophila. Science. 335, 1351-1355 (2012).
- Bellen, H. J. The fruit fly: A model organism to study the genetics of alcohol abuse and addiction. Cell. 93, 909-912 (1998).
- Guarnieri, D. J., Heberlein, U. Drosophila melanogaster, a genetic model system for alcohol research. International Review of Neurobiology. 54, 203-232 (2003).
- Scholz, H. Intoxicated fly brains: Neurons mediating ethanol-induced behaviors. J. Neurogenet. 23, 111-119 (2009).
- Wolf, F. W., Rodan, A. R., Tsai, L. T. Y., Heberlein, U. High-resolution analysis of ethanol-induced locomotor stimulation in Drosophila. J. Neurosci. 22, 11035-11044 (2002).
- Schumann, G., Spanagel, R., Mann, K. Candidate genes for alcohol dependence: Animal studies. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 27, 880-888 (2003).
- Singh, C. M., Heberlein, U. Genetic control of acute ethanol-induced behaviors in Drosophila. Alcohol Clin Exp Res. 24, 1127-1136 (2000).
- Perreau-Lenz, S., Zghoul, T., de Fonseca, F. R., Spanagel, R., Bilbao, A. Circadian regulation of central ethanol sensitivity by the mPer2 gene. Addiction Biology. 14, 253-259 (2009).
- Brager, A. J., Prosser, R. A., Glass, J. D. Circadian and acamprosate modulation of elevated ethanol drinking in mPer2 clock gene mutant mice. Chronobiol. Int. 28, 664-672 (2011).
- Sinclair, J. D., Geller, I. Ethanol consumption by rats under different lighting conditions. Science. 175, 1143-1144 (1972).
- Danel, T., Jeanson, R., Touitou, Y. Temporal pattern in consumption of the first drink of the day in alcohol-dependent persons. Chronobiol. Int. 20, 1093-1102 (2003).
- Kapfhamer, D., et al. Taok2 controls behavioral response to ethanol in mice. Genes, brain, and behavior. 12 (1), 87-97 (2012).
- Lasek, A. W., et al. An evolutionary conserved role for anaplastic lymphoma kinase in behavioral responses to ethanol. PLoS One. 6, 226-236 (2011).
- Lasek, A. W., Giorgetti, F., Berger, K. H., Tayor, S., Heberlein, U. Lmo genes regulate behavioral responses to ethanol in Drosophila melanogaster and the mouse. Alcohol Clin Exp Res. 35, 1600-1606 (2011).
- Lyons, L. C., Roman, G. Circadian modulation of short-term memory in Drosophila. Learning & Memory. 16, 19-27 (2009).
- Hamblen-Coyle, M. J., Wheeler, D. A., Rutila, J. E., Rosbash, M., Hall, J. C. Behavior of period-altered circadian-rhythm mutants of Drosophila in ligh-dark cycles (Diptera Drosophilidae). J. Insect Behav. 5, 417-446 (1992).
- Konopka, R. J., Pittendrigh, C., Orr, D. Reciprocal behavior associated with altered homeostasis and photosensitivity of Drosophila clock mutants. J. Neurogenet. 6, 1-10 (1989).
- Power, J. M., Ringo, J. M., Dowse, H. B. The effects of period mutations and light on the activity rhythms of Drosophila melanogaster. Journal of Biological Rhythms. 10, 267-280 (1995).
- Yoshii, T., et al. Temperature cycles drive Drosophila circadian oscillation in constant light that otherwise induces behavioural arrhythmicity. Eur. J. Neurosci. 22, 1176-1184 (2005).
- Berger, K. H., Heberlein, U., Moore, M. S. Rapid and chronic: two distinct forms of ethanol tolerance in Drosophila. Alcohol Clin Exp Res. 28, 1469-1480 (2004).
- Scholz, H., Ramond, J., Singh, C. M., Heberlein, U. Functional ethanol tolerance in Drosophila. Neuron. 28, 261-271 (2000).
- Kong, E. C., et al. Ethanol-regulated genes that contribute to ethanol sensitivity and rapid tolerance in Drosophila. Alcohol Clin Exp Res. 34, 302-316 (2010).
- Borycz, J., Borycz, J., Kubow, A., Lloyd, V., Meinertzhagen, I. Drosophila ABC transporter mutants white, brown and scarlet have altered contents and distribution of biogenic amines in the brain. J. Exp. Biol. 211, 3454-3466 (2008).
- Sitaraman, D., et al. Serotonin is necessary for place memory in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 5579-5584 (2008).
- Bainton, R. J., et al. Dopamine modulates acute responses to cocaine, nicotine and ethanol in Drosophila. Current Biology. 10, 187-194 (2000).
- Kong, E. C., et al. A pair of dopamine neurons target the D1-like dopamine receptor DopR in the central complex to promote ethanol-stimulated locomotion in Drosophila. Plos One. 5, (2010).
- Xu, J., Kochanek, K. D., Murphy, S. L., Tejada-Vera, B. . Deaths: Final data for 2007. , (2010).
- . The National Center on Addiction and Substance Abuse. Shoveling up II: The impact of substance abuse on federal, state and local budgets. , (2009).
- NIAAA, Estimated economic costs of alcohol abuse in the United States. , (1992).
- Devineni, A. V., Heberlein, U. Preferential ethanol consumption in Drosophila models features of addiction. Current Biology. 19, 2126-2132 (2009).
- Devineni, A. V., Heberlein, U. Addiction-like behavior in Drosophila. Communicative & Integrative Biology. 3, 357-359 (2010).
- Rodan, A. R., Rothenfluh, A. The genetics of behavioral alcohol responses in Drosophila. International Review of Neurobiology. 91, 25-51 (2010).
- Boothroyd, C. E., Young, M. W., Pfaff, D. W., Kieffer, B. Molecular and Biophysical Mechanisms of Arousal, Alertness, and Attention. Annals of the New York Academy of Sciences. 1129, 350-357 (2008).
- Nitabach, M. N., Taghert, P. H. Organization of the Drosophila circadian control circuit. Current Biology. 18, 84-93 (2008).
- Sheeba, V. The Drosophila melanogaster circadian pacemaker circuit. J. Genet. 87, 485-493 (2008).
- Cohan, F. M., Graf, J. -. D. Latitudinal cline in Drosophila melanogaster for knockdown resistance to ethanol fumes and for rates of response to selection for further resistance. Evolution. , 278-293 (1985).
- Moore, M. S., et al. Ethanol intoxication in Drosophila: Genetic and pharmacological evidence for regulation by the cAMP signaling pathway. Cell. 93, 997-1007 (1998).
- Berger, K. H., et al. Ethanol sensitivity and tolerance in long-term memory mutants of Drosophila melanogaster. Alcohol Clin Exp Res. 32, 895-908 (2008).
- Pohl, J. B., et al. Circadian Genes Differentially Affect Tolerance to Ethanol. in Drosophila. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. , (2013).
- Bhandari, P., Kendler, K. S., Bettinger, J. C., Davies, A. G., Grotewiel, M. An assay for evoked locomotor behavior in Drosophila reveals a role for integrins in ethanol sensitivity and rapid ethanol tolerance. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 33, 1794-1805 (2009).
- Rothenfluh, A., et al. Distinct behavioral responses to ethanol are regulated by alternate RhoGAP18B isoforms. Cell. 127, (1016).
