Всего зажим патч для сотовых изучения механизмов Инфракрасный нервного возбуждения
Summary
Инфракрасный нерва была предложена в качестве альтернативы электрической стимуляции в диапазоне нервных типов, включая те, которые связаны с слуховой системы. Этот протокол описывает метод патч зажим для изучения механизма инфракрасного стимуляция нервов в культуре первичных слуховых нейронов.
Abstract
Это было продемонстрировано в последние годы, что импульсный лазер инфракрасного света может быть использован, чтобы вызвать электрические реакции в нервной ткани, независимо от каких-либо дальнейших изменений ткани-мишени. Инфракрасное нейронных стимуляции сообщалось в различных периферийных и сенсорной нервной ткани в живом организме, с особый интерес показано на стимуляцию нейронов слухового нерва. Тем не менее, в то время как INS было показано, что работать в таких условиях, механизм (или механизмы), в котором инфракрасное излучение вызывает нервного возбуждения в настоящее время не очень хорошо понял. Протокол, представленные здесь описывается целой клетки патч зажим метод предназначен для облегчения Исследование инфракрасных нервного возбуждения в культуре первичных слуховых нейронов. Тщательно характеризующие реакцию этих клеток инфракрасного лазерного освещения в пробирке при контролируемых условиях, то можно получить более глубокое понимание фундаментальных Physicaл и биохимических процессов, лежащих в основе инфракрасного нервного возбуждения.
Introduction
Области нейрофизиологии и медицинские бионика во многом полагаются на методы, которые позволяют управляемым стимуляции электрические реакции в нервной ткани. В то время как электрическая стимуляция остается золотым стандартом в нервном возбуждении, он страдает от ряда недостатков, таких как наличие артефактов стимуляции при записи нервные реакции, а также отсутствие стимуляции специфику в связи с распространением тока в окружающие ткани 1.
Последние два десятилетия мы стали свидетелями развития оптически опосредованной стимуляции методы 2. Некоторые из этих методов требует модификации ткани-мишени, либо путем добавления конкретной молекулы (например, клетку молекулы) 3 или некоторую форму генетической манипуляции (например Optogenetics) 4, ни один из которых просты в применении за пределами исследование параметра. Особый интерес поэтому инфракрасный нервного возбуждения (INS), где Ву нервной ткани возбуждается импульсного инфракрасного лазерного излучения. INS имеет потенциал, чтобы преодолеть многие недостатки электрической стимуляции, позволяя весьма специфический, бесконтактные стимуляции нервной ткани 2. Тем не менее, в то время как INS было успешно продемонстрировано в различных условиях, в естественных условиях, точный механизм возбуждения остается неопределенной.
Согласно последним публикациям показали прогресс в раскрытии механизмов, ответственных за INS 5-7. Быстрый нагрев за счет поглощения лазерного излучения водой видимому, играет ключевую роль. Однако, помимо этого консенсуса пока не достигнуто. Шапиро и др.. 7 предлагает весьма общей механизм, посредством быстрого нагрева вызывает возмущение в распределении заряженных частиц, прилегающей к мембране клетки, что приводит к изменению емкости клеточной мембраны и последующей деполяризации. Кроме того, Альберт и др.. 5 утверждают, что Laseт индуцированного нагрева активирует специфический класс чувствительных к температуре ионных каналов (переходный рецепторный потенциал ваниллоидные канала), что ионы проходить через клеточную мембрану. На данном этапе неясно, как эти механизмы сочетаются, да и вообще, есть ли дальнейшие факторы, которые еще не были идентифицированы.
Несмотря на небольшое число публикаций (ссылки 5,7-9) исследовали INS в пробирке, подавляющее большинство работ в этой области опубликовано была проведена в естественных условиях (например, ссылки 1,6,10-18). Инфракрасный стимуляции слуховых нейронов был области, представляющие особый интерес, в связи с потенциальных применений в кохлеарных имплантах 10,14-18. В то время как в естественных условиях эксперименты важно проверить эффективность метода в различных условиях, повышение уровня Контроль, обеспечиваемый в лабораторных исследованиях как ожидается, приведет к более детальному пониманию мехамом ответственность за INS. Данный отчет описывает получение культивируемых нейронов спирального ганглия для исследований патч зажим, так как они могут быть использованы для изучения фундаментальных механизмов а также ссылки на большое количество существующих данных из слуховой системы.
Техника патч зажим является отличным инструментом для исследования электрофизиологических явлений, обеспечивая средства регистрации электрической активности отдельных клеток и изучение вклада отдельных глубинные течения 19. Когда эта методика применяется к стабильной в пробирке подготовка первичных нейронов, таких как культивируемых нейронов спирального ганглия, он предлагает возможность для углубленного изучения механизмов, посредством которых нервная деятельность находится под контролем и манипулировать.
Протоколам, определенным в этой работе методы план исследования влияния лазерной стимуляции на электрические свойства нейронов спирального ганглия через зажим патчзаписей. Этот подход основан на волокном лазерный а не в свободном пространстве лазер, что позволяет безопасно операции, а также легче и более воспроизводимые выравнивание без необходимости модифицировать стандартную конфигурацию микроскопа. На основании этих протоколов, должна быть возможность проводить широкий спектр экспериментов для того, чтобы более четко определить механизм или механизмы, лежащие в INS.
Protocol
Representative Results
Discussion
Использование протоколов изложенных в настоящем документе, можно извлечь и культуре нейронов спирального ганглия и исследовать лазерной вызвало электрическую активность, выполняя целый экспериментов клетки патч зажим. При использовании в пробирке, технику патч зажим обеспечив…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа выполнена при поддержке Австралийского совета исследований при Связь грантового проекта LP120100264.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture materials and equipment | |||
| Glass coverslips | Lomb Scientific | CSC 10 1 GP | |
| 4-ring cell culture dish | VWR International | 82050-542 | |
| Poly-L-ornithine solution | Sigma-Aldrich | P4957 | |
| Laminin | Invitrogen | 23017-015 | |
| Curved forceps | WPI | 14101 | Dumont #5 tweezers (45° angle tip) |
| CO2 Incubator | ThermoScientific | Heracell 150i | |
| Table 1. Cell culture materials and equipment. | |||
| Neurobasal media | |||
| Neurobasal A | Gibco | 10888-022 | |
| N-2 supplement | Invitrogen | 17502-048 | |
| B27 serum-free supplement | Invitrogen | 17504-044 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140-148 | |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030-149 | |
| Intracellular solution | |||
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P4504 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| Potassium D-gluconate | Sigma-Aldrich | G4500 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| Na2ATP | Sigma-Aldrich | A2383 | |
| MgATP | Sigma-Aldrich | A9187 | |
| NaGTP | Sigma-Aldrich | G8877 | |
| Potassium hydroxide | LabServ | BSPPL738.500 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S8501 | |
| Extracellular solution | |||
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | 310166 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P4504 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | 383147 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Sodium hydroxide | LabServ | BSPSL740.500 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S8501 | |
| Table 2. Solutions for cell culture and patch clamp. a) Neurobasal media. b) Intracellular solution. c) Extracellular solution. | |||
| Upright microscope | Zeiss | AxioExaminerD1 | Equipped with Dodt contrast |
| Water-immersion objective | Zeiss | W Plan-APOCHROMAT 40x/0.75 | |
| Platform and X-Y stage | ThorLabs | Burleigh Gibraltar | |
| Recording chamber | Warner Instruments | RC-26G | |
| Vibration isolation table | TMC | Micro-g 63-532 | |
| CCD Camera | Diagnostic Instruments | RT1200 | |
| Camera software | Diagnostic Instruments | SPOT Basic | |
| In-line solution heater | Warner | SH-27B | |
| Temperature controller | Warner | TC-324B | |
| Patch clamp amplifier | Molecular Devices | Multiclamp 700B | |
| Patch clamp data acquisition system | Molecular Devices | Digidata 1440A | |
| Micromanipulator | Sutter Instruments | MPC-325 | |
| Micropipette glass | Sutter Instruments | GBF100-58-15 | Borosilicate glass with filament |
| Micropipette Puller | Sutter Instruments | P2000 | |
| Recording Software | AxoGraph | Lab pack and electrophysiology tools | |
| Aspirator bottle | Sigma-Aldrich | CLS12201L | 1 L Pyrex aspirator bottle, with outlet for tubing |
| PE Tubing | Harvard | PolyE #340 | |
| Masterflex peristaltic pump | Cole-Parmer | HV-07554-85 | |
| Table 3.Patch clamp equipment. | |||
| 1,870 nm laser diode | Optotech | ||
| 200/220 μm diameter multimode optical fiber patch cord (FC/PC) | AFW Technologies | MM1-FC2-200/220-5-C-0.22 | Light delivery optical fiber, silica core and cladding, 0.22 NA |
| Optical fiber through connector (FC/PC) | Thorlabs | ADAFC2 | |
| Optical fiber cleaver | EREM | FO1 | |
| Optical fiber stripping tool (0.25 – 0.6 mm) | Siemens | For removing optical fiber jacket | |
| Optical fiber stripping tool (0.6 – 1.0 mm) | Siemens | For removing outer coating of patch cord | |
| Signal generator | Any signal generator that can output the necessary pulse shapes and is capable of being externally triggered | ||
| Optical fiber positioner | Custom made positioner. Could substitute with standard micropositioner used for patch clamp experiments | ||
| Optical fiber chuck | Newport | FPH-DJ | |
| Laser power meter and detector head | Coherent | FieldMate (power meter) with LM-3 (detector head) | |
| Table 4. Laser equipment. |
References
- Wells, J., Kao, C., Jansen, E. D., Konrad, P., Mahadevan-Jansen, A. Application of infrared light for in vivo neural stimulation. Journal of Biomedical Optics. 10, 064003 (2005).
- Richter, C. P., Matic, A. I., Wells, J. D., Jansen, E. D., Walsh, J. T. Neural stimulation with optical radiation. Laser & Photonics Reviews. 5, 68-80 (2011).
- Kramer, R. H., Fortin, D. L., Trauner, D. New photochemical tools for controlling neuronal activity. Current Opinion in Neurobiology. 19, 544-552 (2009).
- Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neuroscience. 8, 1263-1268 (2005).
- Albert, E. S., et al. Trpv4 channels mediate the infrared laser-evoked response in sensory neurons. Journal of Neurophysiology. 107, 3227-3234 (2012).
- Wells, J., et al. Biophysical mechanisms of transient optical stimulation of peripheral nerve. Biophysical Journal. 93, 2567-2580 (2007).
- Shapiro, M. G., Homma, K., Villarreal, S., Richter, C. -. P., Bezanilla, F. Infrared light excites cells by changing their electrical capacitance. Nature Communications. 3, 736 (2012).
- Bec, J. -. M., et al. Characteristics of laser stimulation by near infrared pulses of retinal and vestibular primary neurons. Lasers in Surgery and Medicine. 44, 736-745 (2012).
- Dittami, G. M., Rajguru, S. M., Lasher, R. A., Hitchcock, R. W., Rabbitt, R. D. Intracellular calcium transients evoked by pulsed infrared radiation in neonatal cardiomyocytes. Journal of Physiology (London). 589, 1295-1306 (2011).
- Izzo, A. D., et al. Laser stimulation of auditory neurons: Effect of shorter pulse duration and penetration depth. Biophysical Journal. 94, 3159-3166 (2008).
- Wells, J., Konrad, P., Kao, C., Jansen, E. D., Mahadevan-Jansen, A. Pulsed laser versus electrical energy for peripheral nerve stimulation. Journal of Neuroscience Methods. 163, 326-337 (2007).
- Teudt, I. U., Nevel, A. E., Izzo, A. D., Walsh, J. T., Richter, C. P. Optical stimulation of the facial nerve: A new monitoring technique. Laryngoscope. 117, 1641-1647 (2007).
- Jenkins, M. W., et al. Optical pacing of the embryonic heart. Nature Photonics. 4, 623-626 (2010).
- Izzo, A. D., Richter, C. P., Jansen, E. D., Walsh, J. T. Laser stimulation of the auditory nerve. Lasers in Surgery and Medicine. 38, 745-753 (2006).
- Izzo, A. D., et al. Selectivity of neural stimulation in the auditory system: A comparison of optic and electric stimuli. J. Biomed. Opt. 12, 021008 (2007).
- Richter, C. P., et al. Optical stimulation of auditory neurons: Effects of acute and chronic deafening. Hearing Research. 242, 42-51 (2008).
- Littlefield, P. D., Vujanovic, I., Mundi, J., Matic, A. I., Richter, C. P. Laser stimulation of single auditory nerve fibers. Laryngoscope. 120, 2071-2082 (2010).
- Izzo, A. D., et al. Optical parameter variability in laser nerve stimulation: A study of pulse duration, repetition rate, and wavelength. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 54, 1108-1114 (2007).
- Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable-membranes. Annual Review of Physiology. 46, 455-472 (1984).
- Needham, K., Nayagam, B. A., Minter, R. L., O’Leary, S. J. Combined application of brain-derived neurotrophic factor and neurotrophin-3 and its impact on spiral ganglion neuron firing properties and hyperpolarization-activated currents. Hearing Research. 291, 1-14 (2012).
- Coleman, B., Fallon, J. B., Pettingill, L. N., de Silva, M. G., Shepherd, R. K. Auditory hair cell explant co-cultures promote the differentiation of stem cells into bipolar neurons. Experimental Cell Research. 313, 232-243 (2007).
- Whitlon, D. S., et al. Survival and morphology of auditory neurons in dissociated cultures of newborn mouse spiral ganglion. Neurosciences. 138, 653-662 (1016).
- Vieira, M., Christensen, B. L., Wheeler, B. C., Feng, A. S., Kollmar, R. Survival and stimulation of neurite outgrowth in a serum-free culture of spiral ganglion neurons from adult mice. Hearing Research. 230, 17-23 (2007).
- Parker, M., Brugeaud, A., Edge, A. S. B. Primary culture and plasmid electroporation of the murine organ of corti. J. Vis. Exp. (36), e1685 (2010).
- Thompson, A. C., Wade, S. A., Brown, W. G. A., Stoddart, P. R. Modeling of light absorption in tissue during infrared neural stimulation. Journal of Biomedical Optics. 17, 075002 (2012).
- Snyder, A. W., Love, J. D. . Optical Waveguide Theory. , (1983).
- Thompson, A. C., Wade, S. A., Cadusch, P. J., Brown, W. G. A., Stoddart, P. R. Modelling of the temporal effects of heating during infrared neural stimulation. J. Biomed. Opt. 18, 035004-0310 (2013).
- Yao, J., Liu, B. Y., Qin, F. Rapid temperature jump by infrared diode laser irradiation for patch-clamp studies. Biophysical Journal. 96, 3611-3619 (2009).
