تنبيغ الفيروسة الغدانية من CD4 الخلايا التائية ساذج لدراسة التمايز Treg
Summary
نقل الجينات الفيروسة الغدانية إلى الخلايا التائية CD4 السذاجة مع التعبير المعدلة وراثيا من مستقبلات اتش كوكساكي يتيح للتحليل الجزيئي للالتنظيمية تمايز الخلايا T<em> في المختبر</em>.
Abstract
الخلايا التائية التنظيمية (Tregs) ضرورية لتوفير التسامح المناعي في تقرير المصير، وكذلك لبعض المستضدات الخارجية. يمكن أن تتولد Tregs من السذاجة خلايا CD4 T في المختبر مع TCR وشارك في التحفيز في وجود TGFβ وIL-2. هذا يحمل إمكانات هائلة لعلاجات المستقبل، ومع ذلك، فإن الجزيئات ومسارات الإشارات التي تمايز التحكم غير معروفة إلى حد كبير.
يمكن التلاعب بها الخلايا التائية الأولية من خلال التعبير الجيني خارج الرحم، ولكن تفشل الطرق الشائعة لاستهداف الدولة السذاجة أهم من الخلية T قبل الاعتراف مستضد الأولية. هنا، ونحن نقدم بروتوكول للتعبير عن الجينات خارج الرحم في السذاجة خلايا CD4 T في المختبر قبل إحداث تمايز Treg. وهو ينطبق تنبيغ مع اتش النسخ المتماثل التي تعاني من نقص ويشرح جيل والإنتاج. واتش يمكن أن يستغرق إدراج كبيرة (تصل إلى 7 كيلو بايت) ويمكن أن تكون مجهزة مع المروجين لتحقيق overexp عالية وعابرةression في الخلايا التائية. فإنه transduces فعال السذاجة خلايا T الماوس إذا كانت تعبر عن المعدلة وراثيا كوكساكي مستقبلات الفيروس الغدي (CAR). الأهم من ذلك، بعد الإصابة تبقى الخلايا التائية السذاجة (CD44 المنخفضة، وارتفاع CD62L) ويستريح (CD25 -، CD69 -) ويمكن تفعيلها ومتباينة في Tregs مماثلة لخلايا غير المصابة. وبالتالي، تمكن هذه الطريقة من التلاعب CD4 T تمايز الخلايا من بدايتها. أنه يضمن التعبير الجيني خارج الرحم هو بالفعل في المكان عندما الأحداث يشير في وقت مبكر من التحفيز TCR الأولي يدفع التغيرات الخلوية التي تؤدي في نهاية المطاف إلى Treg التمايز.
Introduction
Tregs حاسمة للحفاظ على التسامح المناعي وكبح الاستجابات المناعية المبالغة. Tregs قمع المارة تنشيط الخلايا T. ونتيجة لذلك، الاجتثاث من Tregs يؤدي إلى المناعة الذاتية القاتلة والتدمير الذاتي مدفوعا تنشيط خلايا T 1. Tregs تطوير في الغدة الصعترية خلال اختيار السلبية للCD4 السلائف إيجابية واحدة، ولكنها يمكن أيضا التفريق في محيط من السذاجة الخلايا CD4 T على جرعة منخفضة من التحفيز مستضد مع الأمثل 1،2 المشترك التحفيز. الغدة الصعترية Tregs يبدو لقمع المناعة الذاتية أنسجة ضد المستضدات عن النفس، في حين قد تورطت الطرفية Tregs في توفير التسامح في القناة الهضمية أو سرطان الرئة. هذه يسببها Tregs منع أكثر قدرة تنشيط الخلايا T بعد الاعتراف مستضدات الخارجية في الغشاء المخاطي، بما في ذلك مستضدات البيئية من الغذاء والهواء والبكتيريا المتعايشة، والمواد المسببة للحساسية 3،4. وبالإضافة إلى ذلك، Tregs حاسمة لإقامة التسامح الأمهات إلى الببتيدات الجنين 5 وإلى ما قبلتنفيس مرض الطعم ضد المضيف 6. في نفس الوقت، Tregs أيضا توسط آثار غير مرغوب فيها من قبل المخففة المراقبة المناعة من الخلايا السرطانية 7،8. ميزة السمة المميزة للTregs هو تعبير عن مجموعة فرعية-تحديد النسخ عامل Foxp3، وهو عامل شوكة الرأس النسخ المحتوية على نطاق ما هو ضروري وكاف لمنح وظيفة Treg 9،10. ومن المعروف أن بعض مسارات الإشارات التي يمكن أن تحفز التعبير Foxp3. ومع ذلك، فإن العمليات الجزيئية التي تتحكم، وتنظيم، أو تعدل Treg التمايز ردا على مستقبلات الخلايا T اثار مفهومة بشكل أقل.
يمكن على نحو فعال للغاية أن يتسبب Tregs في المختبر من خلال تحفيز السذاجة الخلايا التائية CD4 مع الأجسام المضادة لمكافحة CD3 ومكافحة CD28 في حضور TGFβ وIL-2 11. كما Tregs الناشئة وظيفية في الجسم الحي، والتلاعب من الجزيئات التي تعزز تمايز Treg يحمل إمكانات هائلة لمستقبل therapiوفاق، على سبيل المثال، علاج الربو، مرض الاحساس، وزرع 11،12. على العكس، قد التشكيل العلاجية من الجزيئات لمنع التمايز Treg تقدم فائدة في توجهاته المستقبلية من الجمع بين العلاج من مرضى الأورام.
في فحوصات المختبر تمايز كان لها دور أساسي لوصف التغيرات الجزيئية التي ترتبط مع الخلايا التائية التمايز فرعية. في هذه اللحظة، ومحاولات تجريبية للبحث أو شاشة للمنتجات الجينات التي تتحكم في تمايز الخلايا T يصطدمون بحقيقة أن الأساليب الأكثر شيوعا لحمل خارج الرحم التعبير الجيني في الخلايا T تفشل السذاجة. على سبيل المثال، electroporation وتنبيغ فيروسات الرجعية لا تكون فعالة إلا في تنشيط خلايا تي. وعلى النقيض من التوقعات الأولية، تنبيغ lentiviral، وهو فعال عادة في خلايا يستريح، يتطلب قبل تنشيط خلايا T السذاجة بواسطة السيتوكينات 13. وعلاوة على ذلك، ونقل [كدنا] أو مرنا خلال electroporationينطوي على إزالة الاستقطاب لغشاء البلازما، التي تمنح نفسها ملامح تنشيط الخلايا T وربما حتى تعبئة كا 2 + إشارات وتنشيط بروتينات NFAT (المراقبة غير منشورة والمرجع 14). وبالمثل، لتنبيغ فيروسات الرجعية، وخلايا T السذاجة أن يتم تفعيلها ل18 – 40 ساعة. خلال هذا الوقت، وانهيار الغشاء النووي في سياق انقسام الخلية يحدث ويسمح لإدماج الجيني لاحقة من ناقلات فيروسات الرجعية 15. ولذلك فإن هذه الأساليب ليست قادرة على معالجة تنظيم الجزيئية في وقت مبكر من اللقاء الأولي مع مستضد الخلايا التائية، وهي مرحلة حاسمة من المساعد T تمايز الخلايا.
ومن المعروف تنبيغ الفيروسة الغدانية للتشاور عابرة خارج الرحم التعبير الجيني في عدد من أنواع الخلايا البشرية التي تعبر عن الإنسان كوكساكي مستقبلات الفيروس الغدي (CAR). وتشرع دون الحاجة إلى تنشيط الخلايا أو تقدم دورة الخلية. التعبير سطح CAR أمر ضروري لكفاءة مرفق فيروس واستيعاب، والتعبير المعدلة وراثيا من النسخة اقتطاع CARΔ1 تحت المروج خلية محددة T وجد لتقديم thymocytes الماوس والخلايا T عرضة للإصابة الغدانية 16. الأهم من ذلك أن التحوير لا يغير تطوير خلية توتية أو التمايز في المختبر من خلايا CD4 السذاجة الخلايا التائية إلى مجموعات فرعية مختلفة (لا تظهر البيانات؛ المرجع 17). تنبيغ اتش بوساطة الخلايا T كانت تستخدم سابقا لمن overexpression 17،18 واضعا إلى أسفل النهج 19،20. يمكن تنقية الخلايا T المعدلة وراثيا من المتاحة تجاريا DO11.10 TG؛ CARΔ1 TG (تاكونيك، وشركة والمرجع 17). الأهم من ذلك، تنبيغ الفيروسة الغدانية يسمح التعبير عالية من الجين من الفائدة في الخلايا التائية السذاجة دون التسبب علامات واضحة على التنشيط. تبقى الخلايا التائية السذاجة (CD44 المنخفضة، وارتفاع CD62L) ويستريح (CD25 -، CD69 -) بعد infectiفي ويمكن تفعيلها ومتباينة في Treg مماثلة لخلايا غير المصابة.
ويمكن تحقيق إنتاج الفيروسات الغدية المؤتلف بعد ترنسفكأيشن من الخلايا HEK293A مع البلازميدات الغدانية (الشكل 1). تحتوي هذه البلازميدات عادة نوع الإنسان 5 الجينوم اتش مع الجينات وE1 E3 حذف لتقديم الفيروسات الغدية المؤتلف النسخ المتماثل غير كفء 21. الخلايا HEK293A تكمل نقص النسخ المتماثل كما تم خلدت أنها من خلال التكامل مستقرة من اتش المنفصمة 22. منذ ناقلات الفيروسة الغدانية كبيرة (~ 40 KB) وبالتالي لا مناسبة تماما لقيود التقليدية استنساخ انزيم بوساطة، قمنا بتوظيف النظام عبارة. يتم استنساخ الجينات في المصالح البداية إلى ناقلات دخول أصغر، من التي يمكن نقلها بسهولة إلى ناقلات الوجهة الغدانية عبر امدا رد فعل إعادة التركيب (LR) 23. اقمنا في pCAGAdDu ناقلاتمن خلال الجمع بين المروج CAG (الدجاج المروج الأكتين وCMV محسن) مع كاسيت التعبير التي تحتوي على مواقع LR المرافقة اختيار ccdB بدائي النواة علامة 24. وتنصهر هذه كاسيت التعبير إلى موقع الريبوسوم دخول الداخلي (IRES) العنصر الذي يسمح coexpression للعدوى علامة تعزيز الخضراء بروتين فلوري حقيقية النواة (EGFP)، والتي تنصهر لتسلسل يحتوي على هرمون النمو البقري بولي (A) إشارة. اخترنا تسلسل رابطة الدول المستقلة التنظيم CAG، منذ تم العثور على CMV المروج prototypic أن تكون غاية التي تعتمد على تفعيل وبالتالي غير المواتية للتعبير الجينات في الخلايا التائية السذاجة.
هنا، ونحن نقدم بروتوكول للكفاءة في المختبر Treg التمايز وطريقة لتنبيغ CD4 خلايا تي ساذجة دون تفعيل (الشكل 2). طريقة تمكن خارج الرحم التعبير الجيني أو نهدم CD4 T السابقة تمايز الخلايا في حالة السذاجة. لأنها تتيح اختبار تأثير من overexpresseد الجينات في المصالح أثناء الأحداث يشير في وقت مبكر على التحفيز TCR الأولية حتى T التزام فرعية الخلية. كما توفر التجارب التحقق من صحة لدينا أساس لإنشاء تطبيق اتش مماثلة في التفريق بين مجموعات فرعية أخرى T خلية مثل TH1، TH2، Th9، TH17، Th22، أو خلايا TFH.
Protocol
Representative Results
Discussion
الجيل الفيروسات والمعايرة
من أجل تحقيق النتائج المثلى ترنسفكأيشن، ونوعية وكمية خطي ناقلات يبدو الأكثر أهمية. نحن لم تراع الآثار السلبية على الإنتاج المحللة الأولية من فرط الأولي للثقافة منذ عدوى ستمضي قدما بسرعة بمجرد أن يحدث إن?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
فإن الكتاب أود أن أشكر Lirui دو للبناء ناقلات pCAGAdDU وأوليفر جوركا لأحكام البروتوكول التثبيت.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| pENTR/D-TOPO Cloning Kit | Invitrogen | K240020 |
| Gateway LR Clonase II Enzyme mix | Invitrogen | 11791020 |
| PacI | New England Biolabs | R057S |
| jetPEI | Polyplus-transfection | 101-10N |
| HEK293A Cell Line | Invitrogen | R705-07 |
| A549 | ATCC | CCL-185 |
| 6-well plates | BD Falcon | 353046 |
| 14 cm tissue culture dish | Nunc | 168381 |
| BALB/cJ-Tg(DO11.10)10Dlo Tg(CARΔ1)1Jdgr | Taconic Farms | Model Nr. 4285 |
| Naive CD4+ T Cell Isolation Kit II | Miltenyi Biotech | 130-094-131 |
| DMEM | Invitrogen | 41966-052 |
| FBS | PAN Biotech | 1502-P110704 |
| PenStrep | Invitrogen | 15140-122 |
| RPMI 1640 | Lonza | BE12-167F |
| NaPyruvate | Lonza | BE13-115E |
| NEAA 100x | Lonza | BE13-114E |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030 |
| HEPES Buffer Solution (1 M) | Invitrogen | 15630-056 |
| β-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M-7522 |
| MEM Essential vitamin mixture (100x) | Lonza | 13-607C |
| Dynabeads Mouse T-Activator CD3/CD28 for Cell Expansion and Activation | Invitrogen | 114-56D |
| Recombinant Human TGF-beta 1 | R&D Systems | 240B |
| Proleukin S (18 x 106IE) | Novartis | |
| LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit | Invitrogen | L-23105 |
| Mouse BD Fc BlockT | BD Pharmingen | 553141 |
| Anti-Mouse/Rat Foxp3 PE | eBioscience | 12-5773-82 |
| Mmu-miR-155 TaqMan MicroRNA Assay | Roche Applied Biosystems | 4427975 |
| LightCycler 480 Probes Master | Roche Applied Biosystems | 04902343001 |
| TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit | Roche Applied Biosystems | 4366596 |
References
- Lahl, K., Loddenkemper, C., et al. Selective depletion of Foxp3+ regulatory T cells induces a scurfy-like disease. The Journal of Experimental Medicine. 204 (1), 57-63 (2007).
- Kretschmer, K., Apostolou, I., Hawiger, D., Khazaie, K., Nussenzweig, M. C., von Boehmer, H. Inducing and expanding regulatory T cell populations by foreign antigen. Nature Immunology. 6 (12), 1219-1227 (2005).
- Zhang, X., Izikson, L., Liu, L., Weiner, H. L. Activation of CD25(+)CD4(+) regulatory T cells by oral antigen administration. Journal of Immunology (Baltimore, Md). 167 (8), 4245-4253 (2001).
- Josefowicz, S. Z., Niec, R. E., et al. Extrathymically generated regulatory T cells control mucosal TH2 inflammation. Nature. 482 (7385), 395-399 (2012).
- Samstein, R. M., Josefowicz, S. Z., Arvey, A., Treuting, P. M., Rudensky, A. Y. Extrathymic generation of regulatory T cells in placental mammals mitigates maternal-fetal conflict. Cell. 150 (1), 29-38 (2012).
- Laurence, A., Amarnath, S., et al. STAT3 Transcription Factor Promotes Instability of nTreg Cells and Limits Generation of iTreg Cells during Acute Murine Graft-versus-Host Disease. Immunity. 37 (2), 209-222 (2012).
- Terabe, M., Berzofsky, J. A. Immunoregulatory T cells in tumor immunity. Current Opinion in Immunology. 16 (2), 157-162 (2004).
- Li, X., Kostareli, E., Suffner, J., Garbi, N., Hämmerling, G. J. Efficient Treg depletion induces T-cell infiltration and rejection of large tumors. European Journal of Immunology. 40 (12), 3325-3335 (2010).
- Fontenot, J. D., Gavin, M. A., Rudensky, A. Y. Foxp3 programs the development and function of CD4+CD25+ regulatory T cells. Nature Immunology. 4 (4), 330-336 (2003).
- Hori, S., Nomura, T., Sakaguchi, S. Control of regulatory T cell development by the transcription factor Foxp3. Science. 299 (5609), 1057-1061 (2003).
- Chen, W., Jin, W., et al. Conversion of Peripheral CD4+CD25- Naive T Cells to CD4+CD25+ Regulatory T Cells by TGF-β Induction of Transcription Factor Foxp3. The Journal of Experimental Medicine. 198 (12), 1875-1886 (2003).
- Xu, W., Lan, Q., et al. Adoptive transfer of induced-treg cells effectively attenuates murine airway allergic inflammation. PloS ONE. 7 (7), e40314 (2012).
- Circosta, P., Granziero, L., et al. T cell receptor (TCR) gene transfer with lentiviral vectors allows efficient redirection of tumor specificity in naive and memory T cells without prior stimulation of endogenous TCR. Human Gene Therapy. 20 (12), 1576-1588 (2009).
- Patel, C., Muthuswamy, J. High efficiency, Site-specific Transfection of Adherent Cells with siRNA Using Microelectrode Arrays (MEA). J. Vis. Exp. (67), e4415 (2012).
- Zhong, S., Malecek, K., Perez-Garcia, A., Krogsgaard, M. Retroviral transduction of T-cell receptors in mouse T-cells. J. Vis. Exp. (44), e2307 (2010).
- Leon, R. P., Hedlund, T., et al. Adenoviral-mediated gene transfer in lymphocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (22), 13159-13164 (1998).
- Wan, Y. Y., Leon, R. P., et al. Transgenic expression of the coxsackie/adenovirus receptor enables adenoviral-mediated gene delivery in naive T cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (25), 13784-13789 (2000).
- Hurez, V., Dzialo-Hatton, R., Oliver, J., Matthews, R. J., Weaver, C. T. Efficient adenovirus-mediated gene transfer into primary T cells and thymocytes in a new coxsackie/adenovirus receptor transgenic model. BMC Immunology. 3, 4 (2002).
- Eitelhuber, A. C., Warth, S., et al. Dephosphorylation of Carma1 by PP2A negatively regulates T-cell activation. The EMBO Journal. 30 (3), 594-605 (2011).
- Glasmacher, E., Hoefig, K. P., et al. Roquin binds inducible costimulator mRNA and effectors of mRNA decay to induce microRNA-independent post-transcriptional repression. Nature Immunology. 11 (8), 725-733 (2010).
- Russell, W. C. Update on adenovirus and its vectors. The Journal of General Virology. 81 (Pt. 11), 2573-2604 (2000).
- Graham, F. L., Smiley, J., Russell, W. C., Nairn, R. Characteristics of a Human Cell Line Transformed by DNA from Human Adenovirus Type 5. Journal of General Virology. 36 (1), 59-72 (1977).
- Landy, A. Dynamic, structural, and regulatory aspects of lambda site-specific recombination. Annual Review of Biochemistry. 58, 913-949 (1989).
- Bernard, P., Couturier, M. Cell killing by the F plasmid CcdB protein involves poisoning of DNA-topoisomerase II complexes. Journal of Molecular Biology. 226 (3), 735-745 (1992).
- Thai, T. -. H., Calado, D. P., et al. Regulation of the Germinal Center Response by MicroRNA-155. Science. 316 (5824), 604-608 (2007).
- Rodriguez, A., Vigorito, E., et al. Requirement of bic/microRNA-155 for Normal Immune Function. Science. 316 (5824), 608-611 (2007).
- Cobb, B. S., Hertweck, A., et al. A role for Dicer in immune regulation. The Journal of Experimental Medicine. 203 (11), 2519-2527 (2006).
- Steiner, D. F., Thomas, M. F., et al. MicroRNA-29 Regulates T-Box Transcription Factors and Interferon-γ Production in Helper T Cells. Immunity. , (2011).
