ナイーブCD4のアデノウイルス形質導入Tregの分化を研究するためにT細胞
Summary
ナイーブCD4コクサッキーアデノウイルス受容体のトランスジェニック発現とT細胞へのアデノウイルス遺伝子導入は、制御性T細胞分化の分子解析を可能に<em> in vitroで</em>。
Abstract
制御性T細胞（Tregの）自己にと同様、特定の外来抗原に対する免疫寛容を提供することが不可欠です。 Tregのは、TGFβとIL-2の存在下でのTCRと共刺激を用いたin vitroにおけるナイーブCD4 T細胞から生成することができる。これは、将来の治療のための巨大な潜在力を負担するが、制御分化その分子とシグナル伝達経路は不明な点が多い。
一次T細胞を異所性遺伝子発現を介して操作するが、一般的な方法は、一次抗原認識の前にT細胞の最も重要なナイーブ状態を標的に失敗することができる。ここでは、Tregの分化を誘導する前に、ナイーブCD4における異所性遺伝子のin vitroでのT細胞を表現するためのプロトコルを提供する。これは、複製欠損アデノウイルスで形質導入を適用し、その生成と生産を説明します。アデノウイルスは、大規模な挿入（最大7キロバイト）を取ることができ、高いと過渡overexpを達成するためにプロモーターを装備することができますT細胞におけるression。それらは、トランスジェニックコクサッキーアデノウイルス受容体（CAR）を発現する場合、それは効果的にナイーブマウスのT細胞を伝達する。重要なのは、感染後のT細胞はナイーブ（CD44 低 、CD62L 高い ）と安静時のまま（CD25 – 、CD69 – ）と非感染細胞に類似したTregに活性化し、分化させることができる。したがって、この方法は、初めからCD4 T細胞分化の操作を可能にする。これは、初期のTCR刺激の初期シグナル伝達事象が結局Tregの分化につながる細胞の変化を誘導するとき。その異所性遺伝子発現が既にあることを保証
Introduction
Tregは、免疫寛容を維持し、シュート免疫応答を抑制することが重要である。 Tregのは、バイスタンダーT細胞活性化を抑制する。これにより、Tregのアブレーションは、活性化T細胞1により駆動致命的な自己免疫および自己破壊につながる。 Tregのは、CD4シングルポジティブ前駆体の負の選択時に胸腺で開発が、彼 らはまた、次善の共刺激1,2と低用量の抗原刺激によるナイーブCD4 T細胞から周囲に区別することができます。周辺Tregのが腸や肺の許容範囲を提供することに関与しているのに対し、胸腺Tregのは、自己抗原に対する組織の自己免疫を抑制するように見える。これらの誘導されたTregは強力に食品や空気からの環境抗原、共生細菌、およびアレルゲン3,4含む粘膜における外来抗原の認識後にT細胞活性化を防ぐ。また、Tregのは5胎児のペプチドに母性寛容を確立すると、事前に重要であるベント移植片対宿主病6。同時に、Tregはまた、7,8腫瘍細胞の免疫監視を減衰させることによって不要な効果を媒介する。 Tregの特徴的な機能は、サブセット指定型転写因子Foxp3は、必要かつ機能9,10 Treg細胞を付与するのに十分であるフォークヘッドドメイン含有転写因子の表現である。 Foxp3の発現を誘導することができるいくつかのシグナル伝達経路が知られている。制御、調節、またはトリガするT細胞受容体に応答してTreg細胞分化を調節はあまり理解されているが、分子プロセス。
Tregのは非常に効果的にTGFβとIL-2の存在下で、11抗CD3および抗CD28抗体を用いたナイーブCD4 T細胞の刺激を介してin vitroで誘導することができる。新興Tregのは、生体内で機能しているように、Tregの分化を促進する分子の操作は、将来のための巨大な潜在力therapiを負担エス、例えば、喘息、クローン病、および移植11,12の治療。逆に、Tregの分化を阻止する分子の治療的変調は、腫瘍患者の併用治療の将来のアプローチにおいて利点を提供することができる。
in vitroでの分化アッセイにおいて T細胞サブセットの分化に関連付けられている分子の変化の説明については、尽力してきました。現時点では、検索や制御性T細胞の分化は、異所性遺伝子発現の最も一般的な方法は、ナイーブT細胞で失敗するという事実によって妨げられていることを遺伝子産物をスクリーニングするための実験的な試み。例えば、エレクトロポレーションおよびレトロウイルス形質導入は、活性化T細胞でのみ有効です。当初の予想、休止細胞において、通常効果的であるレンチウイルス形質導入、とは対照的に、サイトカイン13によりナイーブT細胞のプレ活性化が必要です。さらに、エレクトロポレーション時のcDNAまたはmRNAの移転それ自体がT細胞活性化の特徴を付与してものCa 2 +シグナル伝達を動員することができる形質膜の脱分極を含む とNFATタンパク質（未発表の観察とref 14）活性化する。 40時間 – 同様に、レトロウイルス形質導入のために、ナイーブT細胞が18のために活性化されなければならない。この間、細胞分裂の過程で核膜の崩壊が発生し、レトロウイルスベクター15のその後のゲノムに統合することができます。これらのメソッドは、したがって、ヘルパーT細胞分化の決定的な段階である抗原との初期T細胞出会い、初期の分子の規制に対処することはできません。
アデノウイルス形質導入は、ヒトコクサッキーアデノウイルス受容体（CAR）を発現するヒト細胞型の数の一時的な異所性遺伝子発現を付与することが知られている。それは、細胞の活性化または細胞周期の進行を必要とせずに進行する。 Cの表面発現ARは、アデノウイルス感染16の影響を受けやすく、マウス胸腺細胞とT細胞をレンダリングするために発見されたT細胞特異的プロモーターの下で効率的なウイルスの添付ファイルとナリ、と切り捨てバージョンCARΔ1のトランスジェニック発現に必須である。重要なのは、導入遺伝子は胸腺細胞の開発を変更したり、ナイーブCD4 のin vitroでの分化の異なるサブセットにT細胞（示されていないデータ。REF 17） ではありません。 T細胞のアデノウイルス媒介形質導入は、以前に過剰発現17,18とノックダウンアプローチ19,20のために使用された。トランスジェニックT細胞は、市販のDO11.10 TGから精製することができる;CARΔ1TG（タコニック社とref 17）。重要なのは、アデノウイルス形質導入は活性化の明らかな兆候を誘発することなく、ナイーブT細胞での目的遺伝子の高発現を可能にします。 T細胞は、ナイーブなまま（CD44 低 、CD62L 高い ）と休息（CD25 – 、CD69 – ）の後infecti上と非感染細胞に類似Treg細胞に活性化し、分化させることができる。
組換えアデノウイルスの製造は、アデノウイルスプラスミド（図1）HEK293A細胞のトランスフェクション後に達成することができる。これらのプラスミドは通常複製無能な組換えアデノウイルス21をレンダリングするために削除されたE1およびE3遺伝子と人間の5型アデノウイルスゲノムを含んでいます。彼らはせん断アデノウイルス22の安定した統合により不死化されたとしてHEK293A細胞が複製欠乏を補完する。アデノウイルスベクターは、大（〜40キロバイト）、その結果、十分に伝統的な制限酵素媒介クローニングに適していないので、我々は、ゲートウェイシステムを採用。目的の遺伝子は、最初に、簡単にラムダ組換え反応（LR）23を介して宛先アデノウイルスベクターに転送することができ、そこから小さいエントリーベクターにクローニングされる。我々はpCAGAdDuベクトルを構築し原核CCDB選択マーカー24に隣接LR部位を含む発現カセットでCAGプロモーター（ニワトリアクチンプロモーター及びCMVエンハンサー）を組み合わせることにより。この発現カセットは、ウシ成長ホルモンポリAシグナルを含有する配列に融合される真核生物の感染症マーカー強化緑色蛍光タンパク質（EGFP）の共発現を可能にする内部リボソーム侵入部位（IRES）エレメントに融合される。原型CMVプロモーターがナイーブT細胞における遺伝子発現のための非常に活性化に依存するので、不利であることが見出されたので、我々は、CAGシス調節配列を選んだ。
ここで、我々は、in vitro Tregの分化と活性化（図2）ことなく、ナイーブCD4 T細胞を形質導入する方法で効率的にするためのプロトコルを提供します。方法は、異所性遺伝子発現を可能にしたり、素朴な状態で前のCD4のT細胞分化をノックダウン。それはoverexpresseの効果を試験することができT細胞サブセットのコミットメントまで初期のTCR刺激により早期にシグナル伝達事象の間に利害のD遺伝子。当社の検証実験もTh2のようなTh1細胞など他のT細胞サブセット、チューブ内径、Th17細胞、Th22、またはTFH細胞の分化における類似のアデノウイルスアプリケーションを確立するための基礎を提供する。
Protocol
Representative Results
Discussion
ウイルスの生成と滴定
最適なトランスフェクションの結果を得るためには、線状化ベクターの質と量は、最も重要な表示されます。効率的なウイルス産生が発生すると感染症を迅速に進めていきますので、我々は文化の初期の異常増殖からプライマリーライセート生産にマイナスの効果を観察しませんでした。しかし、HEK293A細胞によるウイルス産生効率を低下させる長い?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者は固定プロトコールの提供pCAGAdDUベクトルとオリバーゴルカを構築するためLirui杜に感謝したいと思います。
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| pENTR/D-TOPO Cloning Kit | Invitrogen | K240020 |
| Gateway LR Clonase II Enzyme mix | Invitrogen | 11791020 |
| PacI | New England Biolabs | R057S |
| jetPEI | Polyplus-transfection | 101-10N |
| HEK293A Cell Line | Invitrogen | R705-07 |
| A549 | ATCC | CCL-185 |
| 6-well plates | BD Falcon | 353046 |
| 14 cm tissue culture dish | Nunc | 168381 |
| BALB/cJ-Tg(DO11.10)10Dlo Tg(CARΔ1)1Jdgr | Taconic Farms | Model Nr. 4285 |
| Naive CD4+ T Cell Isolation Kit II | Miltenyi Biotech | 130-094-131 |
| DMEM | Invitrogen | 41966-052 |
| FBS | PAN Biotech | 1502-P110704 |
| PenStrep | Invitrogen | 15140-122 |
| RPMI 1640 | Lonza | BE12-167F |
| NaPyruvate | Lonza | BE13-115E |
| NEAA 100x | Lonza | BE13-114E |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030 |
| HEPES Buffer Solution (1 M) | Invitrogen | 15630-056 |
| β-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M-7522 |
| MEM Essential vitamin mixture (100x) | Lonza | 13-607C |
| Dynabeads Mouse T-Activator CD3/CD28 for Cell Expansion and Activation | Invitrogen | 114-56D |
| Recombinant Human TGF-beta 1 | R&D Systems | 240B |
| Proleukin S (18 x 106IE) | Novartis | |
| LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit | Invitrogen | L-23105 |
| Mouse BD Fc BlockT | BD Pharmingen | 553141 |
| Anti-Mouse/Rat Foxp3 PE | eBioscience | 12-5773-82 |
| Mmu-miR-155 TaqMan MicroRNA Assay | Roche Applied Biosystems | 4427975 |
| LightCycler 480 Probes Master | Roche Applied Biosystems | 04902343001 |
| TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit | Roche Applied Biosystems | 4366596 |
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