Adenoviral Transduksjon av Naive CD4 T-celler for å studere Treg Differensiering

Summary

Adenoviral genoverføring inn naive CD4 T-celler med transgene uttrykk for Coxsackie adenovirus reseptoren gjør den molekylære analyser av regulatoriske T-celle differensiering<em> In vitro</em>.

Abstract

Regulatoriske T-celler (Tregs) er viktige for å gi immuntoleranse til selv så vel som til visse fremmede antigener. Tregs kan genereres fra naive CD4 T-celler in vitro med TCR-og ko-stimulering i nærvær av TGFβ og IL-2. Dette bærer et enormt potensial for fremtidige terapier, men molekylene og signalveier som styrer differensiering er i stor grad ukjent.

Primær T-celler kan manipuleres gjennom svangerskap utenfor genekspresjon, men vanlige metoder ikke klarer å målrette den viktigste naiv tilstand av T-celle før primære antigen anerkjennelse. Her gir vi en protokoll for å uttrykke ektopisk gener for naive CD4 T-celler in vitro før indusere Treg differensiering. Det gjelder transduksjon med replikering-mangelfull adenovirus og forklarer sin generasjon og produksjon. Den adenovirus kan ta opp store innsatser (opptil 7 kb), og kan utstyres med arrangører for å oppnå høy og forbigående overexpression i T-celler. Det transduces effektivt naive mus T-celler hvis de uttrykker en transgen Coxsackie adenovirus reseptor (CAR). Viktigere, etter smitte T-cellene er fortsatt naiv (CD44 ^lav, CD62L ^høy) og hvile (CD25 ^-, CD69 ^-) og kan aktiveres og differensiert i Tregs lik ikke-infiserte celler. Dermed kan denne metoden manipulering av CD4 T-celle differensiering fra begynnelsen. Det sikrer at ektopisk genuttrykk er allerede på plass når tidlige signalering hendelsene i den første TCR stimulering induserer celleforandringer som til slutt fører til Treg differensiering.

Introduction

Tregs er avgjørende for å opprettholde immunforsvaret toleranse og til å dempe skyter immunreaksjoner. Tregs undertrykke tilskuer T celle aktivering. Følgelig fører ablasjon av Tregs til dødelig autoimmunitet og selvødeleggelse drevet av aktiverte T-celler ^en. Tregs utvikles i thymus ved negativ seleksjon av CD4 positive enkelt-forløpere, men de kan også skille i periferien fra naive CD4 T-celler ved lav-dose antigen stimulering med suboptimal ko-stimulering ^1,2. Thymisk Tregs synes å undertrykke vev autoimmunitet mot selv-antigener, mens perifer Tregs har vært innblandet i å gi toleranse i tarmen eller lunge. Disse induserte Tregs potente hindre T celle aktivering etter anerkjennelse av utenlandske antigener i slimhinnene, herunder miljømessige antigener fra mat og luft, commensal bakterier og allergener ^3,4. I tillegg Tregs er avgjørende for å etablere mors toleranse for fosterets peptider ⁵ og å prelufthull graft-versus-host sykdom ^6.. På samme tid, Tregs også mediere uønskede effekter ved å dempe immun overvåking av tumorceller ^7,8. Kjennetegnet av Tregs er uttrykk for den delen-angivelse transkripsjonsfaktor foxp3, en gaffel-head domenenavn som inneholder transkripsjonsfaktor som er nødvendig og tilstrekkelig for å konferere Treg funksjon ^9,10. Noen signalveier som kan indusere foxp3 uttrykk er kjent. Imidlertid er de molekylære prosesser som kontroll, regulere eller modulere Treg differensiering i respons til T-celle-reseptor utløsende mindre godt forstått.

Tregs kan meget effektivt kan bli indusert in vitro gjennom stimulering av naive CD4 T-celler med anti-CD3 og anti-CD28-antistoffer i nærvær av TGFβ og IL-2 ^11. Som den nye Tregs er funksjonelle in vivo, manipulering av molekyler som fremmer Treg differensiering bærer et enormt potensial for fremtidig therapies, for eksempel, ved behandling av astma, Crohns sykdom, og transplantasjon ^11,12. Motsatt kan terapeutisk modulering av molekyler til å blokkere Treg differensiering gi nytte i fremtidige tilnærminger av kombinert behandling av slike pasienter.

In vitro differensiering assay har vært medvirkende til beskrivelsen av molekylære endringer som er forbundet med T-celle undersett differensiering. I øyeblikket, eksperimentelle forsøk på å søke eller skjerm for genprodukter som styrer T-celle differensiering er hemmet av det faktum at de vanligste metodene for ektopisk genuttrykk mislykkes i naive T-celler. For eksempel elektroporering og retroviral transduksjon er bare effektive i aktiverte T-celler. I motsetning til opprinnelige forventninger, lentiviral transduksjon, som vanligvis effektiv i hvilende celler, krever pre-aktivering av naive T-celler av cytokiner ^13. Videre overføring av cDNA eller mRNA under elektroporeringinnebærer depolarisering av cellemembranen, som selv confers trekk ved T-celleaktivering, og kan til og med mobilisere Ca ^{2 +} signalering og aktivere NFAT proteiner (upublisert observasjon og ref.. ^14). Tilsvarende for retroviral transduksjon, naive T-celler har til å bli aktivert for 18 – 40 timer. I løpet av denne tid, forekommer nedbrytning av den nukleære membranen i løpet av celledeling og gjør det mulig for den etterfølgende genomisk integrering av den retrovirale vektoren ^15.. Disse metoder er derfor ikke i stand til å ta opp den molekylære tidlig innledende regulering av T-celle møte med antigen, som er den avgjørende fase av hjelper T celle-differensiering.

Adenoviral transduksjon er kjent for å gi forbigående ektopisk genekspresjon i en rekke humane celletyper som uttrykker human adenovirus Coxsackie-reseptor (CAR). Den fortsetter uten krav til celle aktivering eller celle-syklus progresjon. Overflaten uttrykk for CAR er en forutsetning for effektiv virus tilknytning og internalisering, og transgene ekspresjon av den avkortede versjon CARΔ1 under en T-celle-spesifikk promotor ble funnet å gjengi mus thymocytter og T-celler som er mottakelige for infeksjon adenoviral ^16.. Viktigere, ikke transgene ikke endre thymocyte utvikling eller in vitro differensiering av naive CD4 T-celler i ulike undergrupper (data ikke vist, ref. ^17.). Adenovirus-mediert transduksjon av T-celler ble tidligere brukt for overexpression ^17,18 og knock-down tilnærming ^19,20. De transgene T-celler kan bli renset fra kommersielt tilgjengelig DO11.10 tg; CARΔ1 tg (Taconic, Inc. og ref. ^17..). Viktigste er at adenoviral transduction høyt uttrykk av et gen av interesse for naive T-celler uten å indusere tydelige tegn på aktivering. T-cellene er fortsatt naiv (CD44 ^lav, CD62L ^høy) og hvile (CD25 ^-, CD69 ^-) etter infectipå og kan aktiveres og differensiert i Treg lik ikke-infiserte celler.

Produksjon av rekombinante adenovirus kan oppnås etter transfeksjon av celler med HEK293A adenovirale plasmider (Figur 1). Disse plasmider inneholder vanligvis den menneskelige type 5 adenovirus genom med E1 og E3 gener slettede å gjengi rekombinant adenovirus replikering-inkompetente ^21. HEK293A celler utfylle replikering mangel som de har blitt udødeliggjort gjennom stabil integrering av skåret adenovirus ^22. Siden adenovirus vektorer er store (~ 40 kb), og dermed ikke godt egnet for tradisjonell begrensning enzym-mediert kloning, brukte vi den Gateway-systemet. Genet av interesse blir først klonet inn i en mindre adgang vektor, hvorfra det lett kan overføres til det adenovirale vektor destinasjon via lambda rekombinasjon reaksjon (LR) ^23. Vi konstruerte pCAGAdDu vektorved å kombinere CAG promoter (kylling aktin promoter og CMV forsterker) med et uttrykk kassett som inneholder LR nettsider flankerer prokaryote ccdB seleksjonsmarkør ^24. Denne ekspresjonskassett er sammensmeltet til en intern ribosom inngang stedet (IRES) element som tillater coexpression av den eukaryote infeksjon markør forbedret grønt fluorescerende protein (eGFP), som er kondensert til en sekvens inneholdende det bovine veksthormon poly (A)-signal. Vi valgte CAG cis-regulatoriske sekvenser, ettersom prototypic CMV-promotor ble funnet å være svært aktiveringen-avhengige og derfor ugunstig for genekspresjon i naive T-celler.

Her gir vi en protokoll for effektiv in vitro differensiering Treg og en fremgangsmåte for å transduce naive CD4 T-celler uten aktivering (figur 2). Metoden gjør det mulig ektopisk genekspresjon eller slå ned foregående CD4 T-celle differensiering på naive tilstand. Den lar teste effekten av en overexpressed gen av interesse i løpet av tidlig signalering hendelser ved første TCR stimulering til T-celle undergruppe engasjement. Våre validering eksperimenter også gi grunnlag for å etablere lignende adenovirus programmet i differensiering av andre T celle undergrupper som Th1, Th2, Th9, Th17, Th22, eller TFH celler.

Protocol

En. Kloning av et gen av interesse inn i en post Vector Klon genet av interesse inn i en post vektor. PCR amplifikasjon av genet fulgt av butt-ende ligering inn i en topoisomerase-coupled vektor (f.eks pENTR / D-TOPO) eller restriksjonsenzym-mediert kloning kan anvendes for denne fremgangsmåte. 2. Overføre genet av interesse i pCAGAdDu Destinasjon Vector Overføre genet av interesse fra oppføringen vektor inn destinasjonen vektor av LR rekombinasjon <e…

Representative Results

Virus Produksjon For generering av høye virus titer, er tidspunktet for HEK293A celleinnhøstningsutstyr i primær virus produksjon eller virus forsterkning avgjørende. Representative fluorescerende og fase kontrast med visuelle tegn på virus produksjon er vist i figur 3.. Den CPE ble observert 10 dager etter transfeksjon av HEK293A celler med en kontroll pCAGAdDu vektor uten innsatsen. CPE er preget av utseendet på områder med forstørret og round-up celler som begynner ?…

Discussion

Virus Generation og Titrering

For optimal transfeksjon resultater, kvaliteten og mengden av lineær vektor vises viktigst. Vi observerte ikke negative effekter på primære lysate produksjon fra en innledende overvekst av kulturen siden infeksjonen vil raskt gå en gang effektiv virus produksjon skjer. Imidlertid kan virusproduksjon ved HEK293A celler bli påvirket av lange innstikk som reduserer effektiviteten. Noen åpne leserammene ble faktisk funnet å forstyrre virus produksjon. Disse vira…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number
pENTR/D-TOPO Cloning Kit	Invitrogen	K240020
Gateway LR Clonase II Enzyme mix	Invitrogen	11791020
PacI	New England Biolabs	R057S
jetPEI	Polyplus-transfection	101-10N
HEK293A Cell Line	Invitrogen	R705-07
A549	ATCC	CCL-185
6-well plates	BD Falcon	353046
14 cm tissue culture dish	Nunc	168381
BALB/cJ-Tg(DO11.10)10Dlo Tg(CARΔ1)1Jdgr	Taconic Farms	Model Nr. 4285
Naive CD4+ T Cell Isolation Kit II	Miltenyi Biotech	130-094-131
DMEM	Invitrogen	41966-052
FBS	PAN Biotech	1502-P110704
PenStrep	Invitrogen	15140-122
RPMI 1640	Lonza	BE12-167F
NaPyruvate	Lonza	BE13-115E
NEAA 100x	Lonza	BE13-114E
L-Glutamine	Invitrogen	25030
HEPES Buffer Solution (1 M)	Invitrogen	15630-056
β-Mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M-7522
MEM Essential vitamin mixture (100x)	Lonza	13-607C
Dynabeads Mouse T-Activator CD3/CD28 for Cell Expansion and Activation	Invitrogen	114-56D
Recombinant Human TGF-beta 1	R&D Systems	240B
Proleukin S (18 x 106IE)	Novartis
LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit	Invitrogen	L-23105
Mouse BD Fc BlockT	BD Pharmingen	553141
Anti-Mouse/Rat Foxp3 PE	eBioscience	12-5773-82
Mmu-miR-155 TaqMan MicroRNA Assay	Roche Applied Biosystems	4427975
LightCycler 480 Probes Master	Roche Applied Biosystems	04902343001
TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit	Roche Applied Biosystems	4366596