Adenoviral Transduktion av naiva CD4 T-celler för att studera Treg Differentiering
Summary
Adenoviral genöverföring till naiva CD4 T-celler med transgen uttryck av Coxsackie adenovirus receptor möjliggör molekylär analys av reglerande T-cell differentiering<em> In vitro</em>.
Abstract
Regulatoriska T-celler (Tregs) är väsentliga för att ge immuntolerans att själv liksom till vissa främmande antigener. Tregs kan genereras från naiva CD4 T-celler in vitro med TCR-och co-stimulering i närvaro av TGFp och IL-2. Det bär en enorm potential för framtida terapier, men de molekyler och signalvägar som styr differentiering är till stor del okända.
Primära T-celler kan manipuleras genom ektopisk genuttryck, men vanliga metoder misslyckas med att rikta den viktigaste naiva tillstånd hos T-cellen före primär antigenigenkänning. Här ger vi ett protokoll för att uttrycka ektopisk gener i naiva CD4 T-celler in vitro innan inducera Treg differentiering. Det gäller transduktion med replikering-adenovirus och förklarar sin generation och produktion. Adenoviruset kan ta upp stora insert (upp till 7 kb) och kan utrustas med promotorer för att uppnå hög och övergående OVEREXPression i T-celler. Den omvandlar effektivt naiva celler mus T om de uttrycker en transgen Coxsackie adenovirus receptor (CAR). Viktigt efter infektion T-cellerna förblir naiv (CD44 låg, CD62L hög) och vila (CD25 -, CD69 -) och kan aktiveras och differentieras i Tregs liknande icke-infekterade celler. Således möjliggör denna metod manipulation av CD4 T-cell differentiering från dess allra första början. Det garanterar att ektopisk genuttryck är redan på plats när tidiga signalering händelser i det ursprungliga TCR stimulering inducerar cellförändringar som så småningom leder till Treg differentiering.
Introduction
Tregs är avgörande för att bibehålla immun tolerans och att dämpa överskridande immunsvar. Tregs undertrycka bystander T-cellaktivering. Följaktligen leder ablation av Tregs till dödlig autoimmunitet och självförstörelse drivs av aktiverade T-celler 1. Tregs utvecklas i tymus under negativ selektion av CD4 singel-positiva prekursorer, men de kan också skilja i periferin från naiva CD4 T celler vid låg dos antigenstimulering med suboptimal samstimulering 1,2. Thymic Tregs verkar undertrycka vävnad autoimmunitet mot självantigener, medan perifera Tregs har varit inblandade i att ge tolerans i tarm eller lunga. Dessa inducerade Tregs förhindra potent T-cell aktivering efter erkännande av utländska antigener i slemhinnan, inklusive miljömässiga antigener från mat och luft, bakteriefloran, och allergener 3,4. Dessutom Tregs är avgörande för att fastställa moderns tolerans mot foster peptider 5 och att prevent graft-versus-host sjukdom 6. Samtidigt, Tregs medla även oönskade effekter genom dämpning immunövervakning av tumörceller 7,8. Det kännetecknande inslag i Tregs är ett uttryck för den delmängd-ange transkriptionsfaktor Foxp3, en gaffel-head domän innehållande transkriptionsfaktor som är nödvändig och tillräcklig för att ge Treg funktion 9,10. Vissa signalvägar som kan inducera Foxp3 uttryck är kända. Emellertid är de molekylära processer som styr, reglerar, eller modulerar Treg differentiering som svar på T-cellreceptor utlöser mindre väl förstådd.
Tregs kan mycket effektivt induceras in vitro genom stimulering av naiva CD4 T-celler med anti-CD3 och anti-CD28-antikroppar i närvaro av TGFp och IL-2 11. Som den framväxande Tregs är funktionella in vivo, manipulering av molekyler som främjar Treg differentiering bär en enorm potential för framtida therapies, till exempel, vid behandling av astma, Crohns sjukdom, och transplantation 11,12. Omvänt kan terapeutisk modulering av molekyler för att blockera Treg differentiering ger nytta i framtida strategier för kombinerad behandling av tumör patienter.
In vitro differentiering analyser har varit avgörande för att beskriva molekylära förändringar som är förknippade med T-cell delmängd differentiering. Just nu, experimentella försök att söka eller skärm för genprodukter som styr T-cell differentiering försvåras av det faktum att de vanligaste metoderna för ektopisk genuttryck misslyckas i naiva T-celler. Till exempel, elektroporering och retroviral transduktion är endast effektivt i aktiverade T-celler. I motsats till de ursprungliga förväntningarna, lentiviral transduktion, vilket typiskt är effektivt i vilande celler, kräver föraktivering av naiva T-celler genom cytokiner 13. Vidare överföring av cDNA eller mRNA under elektroporationinvolverar depolarisering av plasmamembranet, som själv ger funktioner i T-cellaktivering och kan även mobilisera Ca 2 +-signalering och aktivera NFAT proteiner (opublicerad observation och ref. 14). Likaså för retroviral transduktion, de naiva T-celler måste aktiveras för 18 – 40 tim. Under denna tid sker fördelningen av det nukleära membranet under celldelning och möjliggör efterföljande genomisk integration av retrovirusvektorn 15. Dessa metoder är därför inte kunde behandlas den tidiga molekylära regleringen av initial T-cell möte med antigen, vilket är den avgörande fasen av hjälpar-T-cell-differentiering.
Adenoviral transduktion är känt för att ge övergående ektopisk genuttryck i ett antal humana celltyper som uttrycker den humana Coxsackie adenovirus receptor (CAR). Det fortsätter utan krav på cell aktivering eller cell-cykel progression. Ytan expression av CAR är nödvändigt för en effektiv virus kvarstad och internalisering, och transgena uttryck för den stympade versionen CARΔ1 enligt en T-cell-specifika promotorn befanns göra mustymocyter och T-celler som är mottagliga för adenovirus infektion 16. Huvudsakligen ändrar transgenen inte tymocyt utveckling eller in vitro differentiering av naiva CD4 T-celler in i olika undergrupper (data visas ej, ref 17.). Adenovirus-medierad transduktion av T-celler har tidigare använts för överuttryck 17,18 och knock-down-strategier 19,20. De transgena T-celler kan renas från kommersiellt tillgänglig DO11.10 tg; CARΔ1 tg (Taconic, Inc. och ref 17.). Viktigt ger adenoviral transduktion högt uttryck av en gen av intresse i naiva T-celler utan att inducera tydliga tecken på aktivering. De T-celler förblir naiv (CD44 låg, CD62L hög) och vila (CD25 -, CD69 -) efter Infectipå och kan aktiveras och differentieras i Treg liknande icke-infekterade celler.
Produktion av rekombinanta adenovirus kan uppnås efter transfektion av HEK293A celler med adenovirala plasmider (figur 1). Dessa plasmider innehåller oftast den mänskliga typen 5 adenovirusgenomet med E1 och E3 gener borttagna för att göra rekombinanta adenovirus replikationsinkompetent 21. HEK293A celler kompletterar replikering brist som de har förevigats genom en stabil integration av klippt adenovirus 22. Eftersom adenovirusvektorer är stora (~ 40 kb) och följaktligen inte väl lämpade för traditionell restriktionsenzym-medierad kloning, använde vi Gateway systemet. Genen av intresse initialt klonas in i en mindre inträde vektor, från vilken den lätt kan överföras till den adenovirala vektorn destinationen via lambda rekombinationsreaktion (LR) 23. Vi konstruerade pCAGAdDu vektorgenom att kombinera CAG-promotorn (kyckling aktin promotor och CMV-förstärkare) med en expressionskassett innehållande LR flankerar det prokaryota ccdB selektionsmarkör 24. Denna expressionskassett är fuserad till ett internt ribosominträdesställe (IRES) element som möjliggör samexpression av den eukaryota infektion markör förbättrade grönt fluorescerande protein (EGFP), som är sammansmält med en sekvens innehållande bovint poly tillväxthormon (A)-signalen. Vi valde de CAG cis-regulatoriska sekvenser, eftersom den prototypiska CMV-promotorn befanns vara starkt aktivering-beroende och därför ogynnsamma för genuttryck i naiva T-celler.
Här ger vi ett protokoll för effektiv in vitro Treg differentiering och en metod för att transducera naiva CD4 T-celler utan aktivering (Figur 2). Metoden möjliggör ektopisk genuttryck eller riva föregående CD4 T-cell differentiering på naiva tillståndet. Den tillåter att testa effekten av en overexpressed gen av intresse under tidiga signalering händelser efter initial TCR stimulering tills T-cell delmängd engagemang. Våra validering experiment ger också grunden för att upprätta liknande adenovirus ansökan i differentieringen av andra T-cell undergrupper såsom Th1, Th2, Th9, Th17, Th22, eller TFH celler.
Protocol
Representative Results
Discussion
Virus Generation och titrering
För optimala transfektion resultat, kvalitet och mängd linjäriserad vektor verkar viktigast. Vi observerade inte negativa effekter på primär lysate produktion från en initial överväxt av kulturen eftersom smittan kommer snabbt vidare när effektiv virus produktionen sker. Däremot kan virusproduktion genom HEK293A celler påverkas av långa skär som minskar effektiviteten. Vissa öppna läsramar faktiskt funnit att störa virus produktion. Dessa virala la…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna vill tacka Lirui Du för att konstruera pCAGAdDU vektor och Oliver Gorka för tillhandahållande av fixeringen protokollet.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| pENTR/D-TOPO Cloning Kit | Invitrogen | K240020 |
| Gateway LR Clonase II Enzyme mix | Invitrogen | 11791020 |
| PacI | New England Biolabs | R057S |
| jetPEI | Polyplus-transfection | 101-10N |
| HEK293A Cell Line | Invitrogen | R705-07 |
| A549 | ATCC | CCL-185 |
| 6-well plates | BD Falcon | 353046 |
| 14 cm tissue culture dish | Nunc | 168381 |
| BALB/cJ-Tg(DO11.10)10Dlo Tg(CARΔ1)1Jdgr | Taconic Farms | Model Nr. 4285 |
| Naive CD4+ T Cell Isolation Kit II | Miltenyi Biotech | 130-094-131 |
| DMEM | Invitrogen | 41966-052 |
| FBS | PAN Biotech | 1502-P110704 |
| PenStrep | Invitrogen | 15140-122 |
| RPMI 1640 | Lonza | BE12-167F |
| NaPyruvate | Lonza | BE13-115E |
| NEAA 100x | Lonza | BE13-114E |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030 |
| HEPES Buffer Solution (1 M) | Invitrogen | 15630-056 |
| β-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M-7522 |
| MEM Essential vitamin mixture (100x) | Lonza | 13-607C |
| Dynabeads Mouse T-Activator CD3/CD28 for Cell Expansion and Activation | Invitrogen | 114-56D |
| Recombinant Human TGF-beta 1 | R&D Systems | 240B |
| Proleukin S (18 x 106IE) | Novartis | |
| LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit | Invitrogen | L-23105 |
| Mouse BD Fc BlockT | BD Pharmingen | 553141 |
| Anti-Mouse/Rat Foxp3 PE | eBioscience | 12-5773-82 |
| Mmu-miR-155 TaqMan MicroRNA Assay | Roche Applied Biosystems | 4427975 |
| LightCycler 480 Probes Master | Roche Applied Biosystems | 04902343001 |
| TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit | Roche Applied Biosystems | 4366596 |
References
- Lahl, K., Loddenkemper, C., et al. Selective depletion of Foxp3+ regulatory T cells induces a scurfy-like disease. The Journal of Experimental Medicine. 204 (1), 57-63 (2007).
- Kretschmer, K., Apostolou, I., Hawiger, D., Khazaie, K., Nussenzweig, M. C., von Boehmer, H. Inducing and expanding regulatory T cell populations by foreign antigen. Nature Immunology. 6 (12), 1219-1227 (2005).
- Zhang, X., Izikson, L., Liu, L., Weiner, H. L. Activation of CD25(+)CD4(+) regulatory T cells by oral antigen administration. Journal of Immunology (Baltimore, Md). 167 (8), 4245-4253 (2001).
- Josefowicz, S. Z., Niec, R. E., et al. Extrathymically generated regulatory T cells control mucosal TH2 inflammation. Nature. 482 (7385), 395-399 (2012).
- Samstein, R. M., Josefowicz, S. Z., Arvey, A., Treuting, P. M., Rudensky, A. Y. Extrathymic generation of regulatory T cells in placental mammals mitigates maternal-fetal conflict. Cell. 150 (1), 29-38 (2012).
- Laurence, A., Amarnath, S., et al. STAT3 Transcription Factor Promotes Instability of nTreg Cells and Limits Generation of iTreg Cells during Acute Murine Graft-versus-Host Disease. Immunity. 37 (2), 209-222 (2012).
- Terabe, M., Berzofsky, J. A. Immunoregulatory T cells in tumor immunity. Current Opinion in Immunology. 16 (2), 157-162 (2004).
- Li, X., Kostareli, E., Suffner, J., Garbi, N., Hämmerling, G. J. Efficient Treg depletion induces T-cell infiltration and rejection of large tumors. European Journal of Immunology. 40 (12), 3325-3335 (2010).
- Fontenot, J. D., Gavin, M. A., Rudensky, A. Y. Foxp3 programs the development and function of CD4+CD25+ regulatory T cells. Nature Immunology. 4 (4), 330-336 (2003).
- Hori, S., Nomura, T., Sakaguchi, S. Control of regulatory T cell development by the transcription factor Foxp3. Science. 299 (5609), 1057-1061 (2003).
- Chen, W., Jin, W., et al. Conversion of Peripheral CD4+CD25- Naive T Cells to CD4+CD25+ Regulatory T Cells by TGF-β Induction of Transcription Factor Foxp3. The Journal of Experimental Medicine. 198 (12), 1875-1886 (2003).
- Xu, W., Lan, Q., et al. Adoptive transfer of induced-treg cells effectively attenuates murine airway allergic inflammation. PloS ONE. 7 (7), e40314 (2012).
- Circosta, P., Granziero, L., et al. T cell receptor (TCR) gene transfer with lentiviral vectors allows efficient redirection of tumor specificity in naive and memory T cells without prior stimulation of endogenous TCR. Human Gene Therapy. 20 (12), 1576-1588 (2009).
- Patel, C., Muthuswamy, J. High efficiency, Site-specific Transfection of Adherent Cells with siRNA Using Microelectrode Arrays (MEA). J. Vis. Exp. (67), e4415 (2012).
- Zhong, S., Malecek, K., Perez-Garcia, A., Krogsgaard, M. Retroviral transduction of T-cell receptors in mouse T-cells. J. Vis. Exp. (44), e2307 (2010).
- Leon, R. P., Hedlund, T., et al. Adenoviral-mediated gene transfer in lymphocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (22), 13159-13164 (1998).
- Wan, Y. Y., Leon, R. P., et al. Transgenic expression of the coxsackie/adenovirus receptor enables adenoviral-mediated gene delivery in naive T cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (25), 13784-13789 (2000).
- Hurez, V., Dzialo-Hatton, R., Oliver, J., Matthews, R. J., Weaver, C. T. Efficient adenovirus-mediated gene transfer into primary T cells and thymocytes in a new coxsackie/adenovirus receptor transgenic model. BMC Immunology. 3, 4 (2002).
- Eitelhuber, A. C., Warth, S., et al. Dephosphorylation of Carma1 by PP2A negatively regulates T-cell activation. The EMBO Journal. 30 (3), 594-605 (2011).
- Glasmacher, E., Hoefig, K. P., et al. Roquin binds inducible costimulator mRNA and effectors of mRNA decay to induce microRNA-independent post-transcriptional repression. Nature Immunology. 11 (8), 725-733 (2010).
- Russell, W. C. Update on adenovirus and its vectors. The Journal of General Virology. 81 (Pt. 11), 2573-2604 (2000).
- Graham, F. L., Smiley, J., Russell, W. C., Nairn, R. Characteristics of a Human Cell Line Transformed by DNA from Human Adenovirus Type 5. Journal of General Virology. 36 (1), 59-72 (1977).
- Landy, A. Dynamic, structural, and regulatory aspects of lambda site-specific recombination. Annual Review of Biochemistry. 58, 913-949 (1989).
- Bernard, P., Couturier, M. Cell killing by the F plasmid CcdB protein involves poisoning of DNA-topoisomerase II complexes. Journal of Molecular Biology. 226 (3), 735-745 (1992).
- Thai, T. -. H., Calado, D. P., et al. Regulation of the Germinal Center Response by MicroRNA-155. Science. 316 (5824), 604-608 (2007).
- Rodriguez, A., Vigorito, E., et al. Requirement of bic/microRNA-155 for Normal Immune Function. Science. 316 (5824), 608-611 (2007).
- Cobb, B. S., Hertweck, A., et al. A role for Dicer in immune regulation. The Journal of Experimental Medicine. 203 (11), 2519-2527 (2006).
- Steiner, D. F., Thomas, M. F., et al. MicroRNA-29 Regulates T-Box Transcription Factors and Interferon-γ Production in Helper T Cells. Immunity. , (2011).
