Adenovirale transductie van Naïeve CD4 T-cellen aan Treg Differentiatie Studie
Summary
Adenovirale genoverdracht in naïeve CD4 T-cellen met transgene expressie van de Coxsackie adenovirus receptor kan de moleculaire analyse van regulatoire T celdifferentiatie<em> In vitro</em>.
Abstract
Regulatoire T-cellen (Tregs) zijn essentieel voor immunotolerantie aan zichzelf en aan bepaalde vreemde antigenen. Tregs kunnen vanuit naïeve CD4 T-cellen in vitro met TCR-en co-stimulering in de aanwezigheid van TGFp en IL-2. Dit draagt enorm potentieel voor toekomstige therapie echter de moleculen en signaalwegen control differentiatie grotendeels onbekend.
Primaire T-cellen kunnen worden gemanipuleerd door ectopische genexpressie, maar gemeenschappelijke methoden niet aan de belangrijkste naïeve toestand van de T-cel te richten voor primaire antigen herkenning. Hier bieden we een protocol om buitenbaarmoederlijke genen tot expressie in naïeve CD4 T-cellen in vitro voor het induceren van Treg differentiatie. Het geldt transductie met de replicatie-deficiënte adenovirus en legt de opwekking en productie. Het adenovirus kan nemen grote inserts (tot 7 kb) en kan worden uitgerust met de initiatiefnemers te hoog en voorbijgaande OVEREXP bereikenression in T-cellen. Het transduceert effectief naïeve muis T-cellen als ze drukken een transgeen Coxsackie adenovirus receptor (CAR). Belangrijk na infectie de T cellen blijven naïeve (CD44 laag, CD62L hoog) en rustend (CD25 -, CD69 -) en kan worden geactiveerd en gedifferentieerd tot Tregs Soortgelijke niet-geïnfecteerde cellen. Zo, deze methode maakt manipulatie van CD4 T-cel differentiatie vanaf het allereerste begin. Het zorgt ervoor dat ectopische genexpressie is al op zijn plaats wanneer vroege signalering gebeurtenissen van de eerste TCR stimulatie induceert cellulaire veranderingen die uiteindelijk leiden naar Treg differentiatie.
Introduction
Tregs zijn cruciaal om immuun tolerantie te handhaven en overschrijding immuunreacties temperen. Tregs onderdrukken omstander T-cel activatie. Bijgevolg ablatie van Tregs leidt tot fatale auto-immuniteit en zelfvernietiging gedreven door geactiveerde T-cellen 1. Tregs in de thymus ontwikkelen in negatieve selectie van CD4-positieve enkelvoudige precursors, maar ze kunnen ook differentiëren in de periferie van naïeve CD4 T-cellen bij lage dosis antigeen stimulatie met suboptimale costimulatie 1,2. Thymus Tregs lijken weefsel auto-immuniteit onderdrukken tegen zelf-antigenen, terwijl perifere Tregs zijn betrokken bij het verstrekken van tolerantie in de darmen of longen. Deze geïnduceerde Tregs krachtig voorkomen dat T-cel activatie na herkenning van vreemde antigenen in het slijmvlies, waaronder milieu-antigenen van voedsel en lucht, commensale bacteriën en allergenen 3,4. Daarnaast Tregs zijn cruciaal voor maternale tolerantie voor foetale peptiden 5 vast te stellen en voorafvent graft-versus-host ziekte 6. Tegelijkertijd, Tregs ook ongewenste effecten mediëren door verzachtende immuunbewaking van tumorcellen 7,8. Het kenmerk kenmerk van Tregs is de uitdrukking van de subset-opgave transcriptiefactor Foxp3, een vork-head domein-bevattende transcriptiefactor die nodig en voldoende is om te overleggen Treg functie 9,10 is. Sommige signaalwegen die Foxp3 expressie kan induceren zijn bekend. Echter, de moleculaire processen die, reguleren of moduleren Treg differentiatie als reactie op T cel receptor activering minder goed begrepen.
Tregs kan zeer effectief worden geïnduceerd in vitro door het stimuleren van naïeve CD4 T-cellen met anti-CD3 en anti-CD28 antilichamen in de aanwezigheid van TGFp en IL-2 11. Zoals de opkomende Tregs zijn functioneel in vivo, de manipulatie van moleculen die Treg differentiatie bevorderen draagt enorm potentieel voor toekomstige therapies, bijvoorbeeld de behandeling van astma, ziekte van Crohn en transplantatie 11,12. Omgekeerd kan therapeutische modulatie van moleculen aan Treg differentiatie blokkeren bieden voordeel in toekomstige aanpak van de gecombineerde behandeling van de tumor patiënten.
In vitro differentiatie assays geleverd tot de beschrijving van moleculaire veranderingen die geassocieerd met T cel subsets. Op dit moment, experimentele pogingen om te zoeken of het scherm voor genproducten die controle T cel differentiatie worden gehinderd door het feit dat de meest voorkomende methoden van ectopische genexpressie falen in naïeve T-cellen. Bijvoorbeeld, elektroporatie en retrovirale transductie zijn alleen effectief in geactiveerde T-cellen. In tegenstelling tot de oorspronkelijke verwachtingen lentivirale transductie, die typisch effectief in rustende cellen vereist pre-activatie van naïeve T-cellen met cytokinen 13. Ook de overdracht van cDNA of mRNA tijdens elektroporatieomvat depolarisatie van het plasmamembraan, dat zich verleent kenmerken van T-cel activatie en zelfs mobiliseren Ca2 + signalering en activeer NFAT eiwitten (niet gepubliceerde waarneming en ref. 14). Ook voor retrovirale transductie, de naïeve T-cellen te worden geactiveerd voor 18-40 uur. Gedurende deze tijd, de verdeling van de kernmembraan tijdens celdeling optreedt en maakt de daaropvolgende genomische integratie van het retrovirale vector 15. Deze werkwijzen zijn dus niet in staat de eerste moleculaire regulatie van initiële T-cel ontmoeting met antigen, de beslissende fase van helper T cel differentiatie pakken.
Adenovirale transductie is bekend om tijdelijke ectopische genexpressie kan in een aantal humane celtypes die de menselijke Coxsackie adenovirus receptor (CAR) drukken. Het verloopt zonder vereiste voor cel activering of cel-cyclus progressie. De oppervlakte-expressie van CAR is essentieel voor een efficiënte virus hechting en internalisatie en transgene expressie van de afgeknotte versie CARΔ1 onder een T-cel-specifieke promoter bleek muis thymocyten en T-cellen gevoelig zijn voor adenovirale infectie 16 maken. Vooral neemt het transgen niet wijzigen thymocyt ontwikkeling of in vitro differentiatie van naïeve CD4 T-cellen in verschillende subsets (gegevens niet getoond; 17 ref.). Adenovirus-gemedieerde transductie van T-cellen werd eerder gebruikt voor overexpressie 17,18 en knock-down-benaderingen 19,20. De transgene T-cellen kan worden gezuiverd uit commercieel verkrijgbare DO11.10 tg; CARΔ1 tg (Taconic, Inc referentie 17.). Belangrijk adenovirale transductie maakt hoge expressie van een gen van interesse in naïeve T-cellen induceren zonder duidelijke tekenen van activatie. De T-cellen blijft naïef (CD44 laag, CD62L hoog) en rust (CD25 -, CD69 -) na infectiop en kan worden geactiveerd en gedifferentieerd tot Treg Soortgelijke niet-geïnfecteerde cellen.
Productie van recombinante adenovirussen kan worden bereikt na transfectie van adenovirale HEK293A cellen met plasmiden (figuur 1). Deze plasmiden bevatten doorgaans de menselijke soort 5 adenovirusgenoom met E1 en E3 genen verwijderd om recombinante adenovirussen replicatie-incompetent 21 renderen. HEK293A cellen vullen replicatie-deficiëntie, zoals ze werden vereeuwigd door middel van stabiele integratie van geschoren adenovirus 22. Aangezien adenovirale vectoren zijn groot (~ 40 kb) en dus niet geschikt voor de traditionele restrictie-enzym-gemedieerde klonen, gebruikten we het Gateway systeem. Het gen van belang wordt eerst gekloneerd in een kleinere vermelding vector, waaruit het gemakkelijk kan worden overgebracht naar de bestemming adenovirale vector lambda via recombinatie reactie (LR) 23. We geconstrueerde de pCAGAdDu vectordoor het combineren van de CAG promotor (kip actinepromotor en CMV versterker) met een expressie-cassette met LR locaties aan weerszijden van de procaryotische ccdB selectie marker 24. Deze expressiecassette gefuseerd met een interne ribosoom toegangsplaats (IRES) element dat co-expressie van eukaryote marker infectie versterkt groen fluorescent proteïne (eGFP), dat is gefuseerd aan een sequentie die het bovine groeihormoon poly (A)-signaal mogelijk maakt. We kozen CAG cis-regulerende sequenties, omdat het prototype CMV promoter werd gevonden sterk activatie-afhankelijk en daardoor ongunstig voor genexpressie in naïeve T-cellen zijn.
Hier geven we een protocol voor efficiënte in vitro Treg differentiatie en een methode om naïeve CD4 T-cellen te transduceren zonder activatie (Figuur 2). De methode maakt ectopische genexpressie of knock down voorgaande CD4 T-cel differentiatie bij de naïeve staat. Het maakt het testen van het effect van een overexpressed gen van belang tijdens de vroege signalering evenementen bij eerste TCR stimulatie tot T-cel deelverzameling inzet. Onze validatie-experimenten geven ook de basis om soortgelijke adenovirus toepassing in de differentiatie van andere T-cel subsets zoals Th1, Th2, Th9, Th17, Th22, of Tfh cellen vast te stellen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Virusproductie en titratie
Voor optimale transfectie resultaten, de kwaliteit en de hoeveelheid gelineariseerde vector uiterst belangrijk. We hadden geen negatieve effecten hebben op de primaire productie lysaat observeren vanuit een aanvankelijke sterke groei van de cultuur sinds de infectie zal snel overgaan zodra efficiënte virus productie plaatsvindt. Echter, virusproductie door HEK293A cellen worden beïnvloed door lange inserts die de doeltreffendheid verminderen. Sommige open reading fr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs willen graag Lirui Du bedanken voor het construeren van de pCAGAdDU vector en Oliver Gorka voor bepaling van de fixatie protocol.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| pENTR/D-TOPO Cloning Kit | Invitrogen | K240020 |
| Gateway LR Clonase II Enzyme mix | Invitrogen | 11791020 |
| PacI | New England Biolabs | R057S |
| jetPEI | Polyplus-transfection | 101-10N |
| HEK293A Cell Line | Invitrogen | R705-07 |
| A549 | ATCC | CCL-185 |
| 6-well plates | BD Falcon | 353046 |
| 14 cm tissue culture dish | Nunc | 168381 |
| BALB/cJ-Tg(DO11.10)10Dlo Tg(CARΔ1)1Jdgr | Taconic Farms | Model Nr. 4285 |
| Naive CD4+ T Cell Isolation Kit II | Miltenyi Biotech | 130-094-131 |
| DMEM | Invitrogen | 41966-052 |
| FBS | PAN Biotech | 1502-P110704 |
| PenStrep | Invitrogen | 15140-122 |
| RPMI 1640 | Lonza | BE12-167F |
| NaPyruvate | Lonza | BE13-115E |
| NEAA 100x | Lonza | BE13-114E |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030 |
| HEPES Buffer Solution (1 M) | Invitrogen | 15630-056 |
| β-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M-7522 |
| MEM Essential vitamin mixture (100x) | Lonza | 13-607C |
| Dynabeads Mouse T-Activator CD3/CD28 for Cell Expansion and Activation | Invitrogen | 114-56D |
| Recombinant Human TGF-beta 1 | R&D Systems | 240B |
| Proleukin S (18 x 106IE) | Novartis | |
| LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit | Invitrogen | L-23105 |
| Mouse BD Fc BlockT | BD Pharmingen | 553141 |
| Anti-Mouse/Rat Foxp3 PE | eBioscience | 12-5773-82 |
| Mmu-miR-155 TaqMan MicroRNA Assay | Roche Applied Biosystems | 4427975 |
| LightCycler 480 Probes Master | Roche Applied Biosystems | 04902343001 |
| TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit | Roche Applied Biosystems | 4366596 |
References
- Lahl, K., Loddenkemper, C., et al. Selective depletion of Foxp3+ regulatory T cells induces a scurfy-like disease. The Journal of Experimental Medicine. 204 (1), 57-63 (2007).
- Kretschmer, K., Apostolou, I., Hawiger, D., Khazaie, K., Nussenzweig, M. C., von Boehmer, H. Inducing and expanding regulatory T cell populations by foreign antigen. Nature Immunology. 6 (12), 1219-1227 (2005).
- Zhang, X., Izikson, L., Liu, L., Weiner, H. L. Activation of CD25(+)CD4(+) regulatory T cells by oral antigen administration. Journal of Immunology (Baltimore, Md). 167 (8), 4245-4253 (2001).
- Josefowicz, S. Z., Niec, R. E., et al. Extrathymically generated regulatory T cells control mucosal TH2 inflammation. Nature. 482 (7385), 395-399 (2012).
- Samstein, R. M., Josefowicz, S. Z., Arvey, A., Treuting, P. M., Rudensky, A. Y. Extrathymic generation of regulatory T cells in placental mammals mitigates maternal-fetal conflict. Cell. 150 (1), 29-38 (2012).
- Laurence, A., Amarnath, S., et al. STAT3 Transcription Factor Promotes Instability of nTreg Cells and Limits Generation of iTreg Cells during Acute Murine Graft-versus-Host Disease. Immunity. 37 (2), 209-222 (2012).
- Terabe, M., Berzofsky, J. A. Immunoregulatory T cells in tumor immunity. Current Opinion in Immunology. 16 (2), 157-162 (2004).
- Li, X., Kostareli, E., Suffner, J., Garbi, N., Hämmerling, G. J. Efficient Treg depletion induces T-cell infiltration and rejection of large tumors. European Journal of Immunology. 40 (12), 3325-3335 (2010).
- Fontenot, J. D., Gavin, M. A., Rudensky, A. Y. Foxp3 programs the development and function of CD4+CD25+ regulatory T cells. Nature Immunology. 4 (4), 330-336 (2003).
- Hori, S., Nomura, T., Sakaguchi, S. Control of regulatory T cell development by the transcription factor Foxp3. Science. 299 (5609), 1057-1061 (2003).
- Chen, W., Jin, W., et al. Conversion of Peripheral CD4+CD25- Naive T Cells to CD4+CD25+ Regulatory T Cells by TGF-β Induction of Transcription Factor Foxp3. The Journal of Experimental Medicine. 198 (12), 1875-1886 (2003).
- Xu, W., Lan, Q., et al. Adoptive transfer of induced-treg cells effectively attenuates murine airway allergic inflammation. PloS ONE. 7 (7), e40314 (2012).
- Circosta, P., Granziero, L., et al. T cell receptor (TCR) gene transfer with lentiviral vectors allows efficient redirection of tumor specificity in naive and memory T cells without prior stimulation of endogenous TCR. Human Gene Therapy. 20 (12), 1576-1588 (2009).
- Patel, C., Muthuswamy, J. High efficiency, Site-specific Transfection of Adherent Cells with siRNA Using Microelectrode Arrays (MEA). J. Vis. Exp. (67), e4415 (2012).
- Zhong, S., Malecek, K., Perez-Garcia, A., Krogsgaard, M. Retroviral transduction of T-cell receptors in mouse T-cells. J. Vis. Exp. (44), e2307 (2010).
- Leon, R. P., Hedlund, T., et al. Adenoviral-mediated gene transfer in lymphocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (22), 13159-13164 (1998).
- Wan, Y. Y., Leon, R. P., et al. Transgenic expression of the coxsackie/adenovirus receptor enables adenoviral-mediated gene delivery in naive T cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (25), 13784-13789 (2000).
- Hurez, V., Dzialo-Hatton, R., Oliver, J., Matthews, R. J., Weaver, C. T. Efficient adenovirus-mediated gene transfer into primary T cells and thymocytes in a new coxsackie/adenovirus receptor transgenic model. BMC Immunology. 3, 4 (2002).
- Eitelhuber, A. C., Warth, S., et al. Dephosphorylation of Carma1 by PP2A negatively regulates T-cell activation. The EMBO Journal. 30 (3), 594-605 (2011).
- Glasmacher, E., Hoefig, K. P., et al. Roquin binds inducible costimulator mRNA and effectors of mRNA decay to induce microRNA-independent post-transcriptional repression. Nature Immunology. 11 (8), 725-733 (2010).
- Russell, W. C. Update on adenovirus and its vectors. The Journal of General Virology. 81 (Pt. 11), 2573-2604 (2000).
- Graham, F. L., Smiley, J., Russell, W. C., Nairn, R. Characteristics of a Human Cell Line Transformed by DNA from Human Adenovirus Type 5. Journal of General Virology. 36 (1), 59-72 (1977).
- Landy, A. Dynamic, structural, and regulatory aspects of lambda site-specific recombination. Annual Review of Biochemistry. 58, 913-949 (1989).
- Bernard, P., Couturier, M. Cell killing by the F plasmid CcdB protein involves poisoning of DNA-topoisomerase II complexes. Journal of Molecular Biology. 226 (3), 735-745 (1992).
- Thai, T. -. H., Calado, D. P., et al. Regulation of the Germinal Center Response by MicroRNA-155. Science. 316 (5824), 604-608 (2007).
- Rodriguez, A., Vigorito, E., et al. Requirement of bic/microRNA-155 for Normal Immune Function. Science. 316 (5824), 608-611 (2007).
- Cobb, B. S., Hertweck, A., et al. A role for Dicer in immune regulation. The Journal of Experimental Medicine. 203 (11), 2519-2527 (2006).
- Steiner, D. F., Thomas, M. F., et al. MicroRNA-29 Regulates T-Box Transcription Factors and Interferon-γ Production in Helper T Cells. Immunity. , (2011).
