Приобретение флуоресценции интервальной съемки бутонизации дрожжей и анализ Одноклеточный динамики с использованием ПРОТЕЗОВ
Summary
Мы представляем простой протокол для получения флуоресцентного микроскопа фильмы растущих клеток дрожжей и на основе графического интерфейса программного пакета для извлечения одноклеточные данных временных рядов. Анализ включает в себя автоматизированные линии и временного разделения назначения интегрирована с визуальным осмотром и ручным курирование гусеничном данных.
Abstract
Флуоресценции покадровой микроскопии стал мощным инструментом в изучении многих биологических процессов на уровне одной клетки. В частности, фильмы изображающие временную зависимость экспрессии генов дают представление о динамике ее регулирования, однако, есть много технических проблем в получении и анализе фильмов флуоресценции одиночных клеток. Здесь описан простой протокол с использованием коммерчески доступной культуры микрожидкостных устройств для получения таких данных, и MATLAB основе, графический пользовательский интерфейс (GUI) на основе пакета программного обеспечения для количественного флуоресцентного изображений. Программное обеспечение сегментов и дорожек клетки, позволяет пользователю визуально отбора с ошибками в данных, и автоматически присваивает линии и разделения времени. GUI дальнейшем анализируются временные ряды для производства целого следы клеток, а также их первые и вторые производные по времени. В то время как программное обеспечение было разработано для S. CEREVISIAE, ее модульность и универсальность должна позволить его тØ служить в качестве платформы для изучения других типов клеток, с некоторыми изменениями.
Introduction
Одноклеточные анализ экспрессии генов содействовало нашему пониманию многих аспектов регуляции генов. Статические снимки флуоресцентных выражения репортера использованием проточной цитометрии или микроскопии дать полезную информацию о распределении одноклеточные выражения, но не хватает истории и эволюции временных рядов данных, необходимых для непосредственно информировать динамики экспрессии генов. Флуоресценции покадровой микроскопии представляет собой средство для получения как одноклеточные измерений и их истории. Различные экспериментальные и аналитические методы были разработаны для получения и количественной флуоресцентной фильмы выражения репортером, передавая, таким образом взглянуть на особенности регуляции генов (см. 1 для обзора), такие как клетки к клетке изменения 2,3, бактериальной формирования стойкая бактерия 4, транскрипция инициирование и удлинение 5, транскрипционные разрыва 6,7, клеточного цикла зависимость 8,9, 10 и наследуемости. Тем не менее, OBTAining качество одноклеточные флуоресценции временной ряд включает в себя значительные технические проблемы в культивирования монослой клеток в контролируемой окружающей среде и в высокой пропускной количественного приобретенных фильмов флуоресценции. Здесь мы описываем процедуру для получения и анализа флуоресценции фильмов С. CEREVISIAE, без необходимого опыта в клеточной культуре производства устройства или в разработке программного обеспечения (рис. 1).
Во-первых, мы подробно пример протокола для создания фильмов флуоресценции временных рядов для начинающих дрожжей, экспрессирующих один или более флуоресцентных журналистам. Хотя индивидуальные микрожидкостной камер культуры были построены и успешно использовались ранее 11-13, мы используем имеющиеся в продаже устройства от микрожидкостной CellAsic (Hayward, Калифорния). Система пределы клетки монослоя роста и обеспечивает постоянный контроль перфузии среды. Микроскопии протокола мы представляем собой простой способ получить fluorescENCE фильмы бутонизации дрожжи, но любое изменение экспериментальный протокол (индивидуальные устройства культуры, альтернативные условия среды и т.д.). обеспечивая такую же данных флуоресценции фильм одиночных клеток дрожжей может быть замещен.
Далее мы приводим анализ фильмов с помощью графического интерфейса пользователя (GUI) на основе пакета программного обеспечения в MATLAB (Mathworks, Натик, штат Массачусетс), получивший название графический интерфейс для быстрого анализа флуоресценции временных рядов (черенки) для извлечения данных временных рядов для отдельных клеток. ПРОТЕЗОВ имеет аналогичные характеристики с универсальным, открытым исходным кодом пакета Cell-ID 14 в сегментации и отслеживания клетки и в извлечении интенсивности флуоресценции и геометрическую информацию. Тем не менее, важно ПРОТЕЗОВ предоставляет дополнительные возможности. Во-первых, он предлагает легкий интерактивного редактирования сегментации и отслеживания результатов для проверки точности данных, а не только статистические стробирования выброс регионе следов после анализа. Более того, она расширяет анализ automaticallY назначают происхождение и клеточного цикла достопримечательности бутонизации дрожжей. Определение, когда мать и дочь делятся, для формирования двух независимых регионах ячейки имеет решающее значение для определения целой клетки (мать включая любые связанные BUD) измерений в течение всего клеточного цикла 8. Номер состоит из трех модулей для выполнения этих задач. Первая ячейка сегменты регионов на основе контраста между целенаправленной и сфокусировано яркие образы поля, а также позволяет пользователю определить и визуально проверить параметры сегментации. Вторых путей (. Блэр и использованием MATLAB реализации Dufresne о Крокер и др. рутинных IDL, по адресу: http://physics.georgetown.edu/MATLAB/ ) и измеряет ячейку регионов во времени; автоматически назначает линий, а также дает возможность визуального контроля и коррекции ошибок. Простое построение GUI включен в запрос одноклеточные свойствами. Третий модуль приписывает появление бутон и деления Tiмес, и выводит целой клетки временные ряды данных, а также их первых и вторых производных по времени (как описано в 9). Модуль анализа выводит данные в виде разделенных пробелами текстовый файл для последующего исследования статистическим программным обеспечением выбора. Таким образом, пакет позволяет пользователю извлекать данные высокого качества времени последовательно через графический интерфейс. Мы использовали этот метод оценки в реальном времени цены транскрипции в одном перспективных дрожжевых клеток в зависимости от клеточного цикла 9. В то время как модуль оптимизирован для начинающих дрожжи, параметров или, при необходимости, свободно доступны код может быть адаптирован для других организмов и типов изображений. Алгоритмы сегментации, отслеживания и назначения линии могут быть специфическими для типов изображений и назначен рассматриваемого организма. Существующие алгоритмы можно было бы заменить, но все еще сохраняют GUI интерфейс, который позволяет удобный визуальный контроль и коррекция сегментации и отслеживания ошибок, которые неизменно OCCUR с любым алгоритмом.
Protocol
Representative Results
Discussion
Выше протоколе описывается простой метод для получения и анализа данных флуоресценции временных рядов с ограниченным опытом в микрофлюидики или в разработке программного обеспечения. Это позволяет получить покадровой фильмы флуоресценции одиночных клеток дрожжей; извлечь соответс…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Эмили Джексон, Джошуа Зейдман, а Николай Реном для комментариев на программное обеспечение. Эта работа финансировалась GM95733 (в Нью-Мексико), BBBE 103316 и Массачусетский технологический институт запуске фондов (в нм).
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Y04C Yeast Perfusion Plate | CellAsic | Y04C-02 | |
| ONIX Microfluidic Perfusion Platform | CellAsic | EV-262 | |
| Axio Observer.Z1 Microscope | Zeiss | ||
| Plan-Apochromat 63X/1.40 Oil DIC objective | Zeiss | 440762-9904-000 | |
| Cascade II EMCCD camera | Photometrics | ||
| Lumen 200 metal-halide arc lamp | PRIOR Scientific | ||
| Triple-bandpass dichroic filter cube and excitation and emission filter set | Chroma Technology Corp | set #89006 | Used for YFP (Venus/Citrine), CFP (Cerulean), RFP (mCherry/tdTomato) |
| MAC 5000 controller and filter wheels | Ludl Electronic Products | ||
| MATLAB R2011a | Mathworks | 64-bit version handles large data files better than 32-bit |
References
- Locke, J. C. W., Elowitz, M. B. Using movies to analyse gene circuit dynamics in single cells. Nature Reviews. Microbiology. 7 (5), 383-392 (2009).
- Rosenfeld, N., Young, J. W., Alon, U., Swain, P. S., Elowitz, M. B. Gene Regulation at the Single-Cell Level. Science. 307 (5717), 1962-1965 (2005).
- Colman-Lerner, A., Gordon, A., et al. Regulated cell-to-cell variation in a cell-fate decision system. Nature. 437 (7059), 699-706 (2005).
- Vega, N. M., Allison, K. R., Khalil, A. S., Collins, J. J. Signaling-mediated bacterial persister formation. Nature Chemical Biology. 8 (5), 431-433 (2012).
- Larson, D. R., Zenklusen, D., Wu, B., Chao, J. A., Singer, R. H. Real-Time Observation of Transcription Initiation and Elongation on an Endogenous Yeast Gene. Science. 332 (6028), 475-478 (2011).
- Golding, I., Paulsson, J., Zawilski, S., Cox, E. Real-time kinetics of gene activity in individual bacteria. Cell. 123 (6), 1025-1061 (2005).
- Suter, D. M., Molina, N., Gatfield, D., Schneider, K., Schibler, U., Naef, F. Mammalian Genes Are Transcribed with Widely Different Bursting Kinetics. Science. 332 (6028), 472-474 (2011).
- Cookson, N. A., Cookson, S. W., Tsimring, L. S., Hasty, J. Cell cycle-dependent variations in protein concentration. Nucleic Acids Research. 38 (8), 2676-2681 (2010).
- Zopf, C. J., Quinn, K., Zeidman, J., Maheshri, N. Cell-cycle dependence of transcription dominates noise in gene expression. , (2013).
- Kaufmann, B. B., Yang, Q., Mettetal, J. T., Van Oudenaarden, A. Heritable stochastic switching revealed by single-cell genealogy. PLoS Biology. 5 (9), e239 (2007).
- Cookson, S., Ostroff, N., Pang, W. L., Volfson, D., Hasty, J. Monitoring dynamics of single-cell gene expression over multiple cell cycles. Molecular Systems Biology. 1 (1), 2005.0024 (2005).
- Paliwal, S., Iglesias, P. A., Campbell, K., Hilioti, Z., Groisman, A., Levchenko, A. MAPK-mediated bimodal gene expression and adaptive gradient sensing in yeast. Nature. 446 (7131), 46-51 (2007).
- Charvin, G., Cross, F. R., Siggia, E. D. A microfluidic device for temporally controlled gene expression and long-term fluorescent imaging in unperturbed dividing yeast cells. PloS One. 3 (1), e1468 (2008).
- Gordon, A., Colman-Lerner, A., Chin, T. E., Benjamin, K. R., Yu, R. C., Brent, R. Single-cell quantification of molecules and rates using open-source microscope-based cytometry. Nat. Meth. 4 (2), 175-181 (2007).
- Otsu, N. A Threshold Selection Method from Gray-Level Histograms. IEEE Trans. Sys. Man. Cyber. 9 (1), 62-66 (1979).
- Goranov, A. I., Cook, M., et al. The rate of cell growth is governed by cell cycle stage. Genes & Development. 23 (12), 1408-1422 (2009).
- To, T. -. L., Maheshri, N. Noise Can Induce Bimodality in Positive Transcriptional Feedback Loops Without Bistability. Science. 327 (5969), 1142-1145 (2010).
- O’Neill, E. M., Kaffman, A., Jolly, E. R., O’Shea, E. K. Regulation of PHO4 nuclear localization by the PHO80-PHO85 cyclin-CDK complex. Science. 271 (5246), 209-212 (1996).
- Raser, J. M., O’Shea, E. K. Control of stochasticity in eukaryotic gene expression. Science. 304 (5678), 1811-1814 (2004).
