L'acquisition de fluorescence Time-lapse films de levure bourgeonnante et analyse de la dynamique de cellules uniques en utilisant des greffes

Résumé

Nous présentons un protocole simple d'obtenir des films de microscopie par fluorescence de cellules de levure en croissance, et un logiciel GUI basée à extraire des données de séries chronologiques unicellulaires. L'analyse comprend lignée automatisé et l'affectation du temps de division intégrée à l'inspection visuelle et la conservation manuelle de données à chenilles.

Résumé

Microscopie time-lapse fluorescence est devenu un outil puissant dans l'étude de nombreux processus biologiques au niveau d'une seule cellule. En particulier, les films dépeignant la dépendance temporelle de l'expression des gènes permettent de mieux comprendre la dynamique de sa réglementation, mais il ya beaucoup de défis techniques à obtenir et à analyser les films de fluorescence des cellules individuelles. Nous décrivons ici un protocole simple en utilisant un dispositif de culture microfluidique disponible dans le commerce pour produire ces données, et une interface graphique basée sur MATLAB utilisateur (GUI) basée sur logiciel pour quantifier les images de fluorescence. Les segments des logiciels et des cellules de pistes, permet à l'utilisateur de vicaire visuellement erreurs dans les données, et attribue automatiquement lignage et des temps de division. L'interface graphique analyse en outre la série temporelle afin de produire des traces de cellules entières, ainsi que leurs dérivées première et seconde de temps. Bien que le logiciel a été conçu pour S. cerevisiae, sa modularité et sa polyvalence devrait lui permettre de to servir de plate-forme pour l'étude d'autres types cellulaires avec quelques modifications.

Introduction

Analyse unicellulaire de l'expression génique a permis de mieux comprendre de nombreux aspects de la régulation des gènes. Instantanés statiques d'expression rapporteur fluorescent par cytométrie en flux ou microscopie fournissent des informations utiles sur la distribution de l'expression seule cellule, mais n'ont pas l'histoire et l'évolution des données de séries chronologiques nécessaires pour informer directement la dynamique de l'expression des gènes. Microscopie time-lapse fluorescence présente un moyen d'obtenir deux mesures unicellulaires et leur histoire. Diverses techniques expérimentales et analytiques ont été développées a....

Protocole

1. Obtenir fluorescentes microscopie Films de cellules de levure unique qui poussent dans une chambre microfluidique

1. Inoculer 1 ml médias SC (médias définis synthétiques avec 2% de glucose et le complément complet d'acides aminés) avec des cellules d'une plaque fraîchement croissante, et incuber la culture de la nuit environ 16 heures sur un tambour à rouleaux à 30 ° C. Préparer la culture tels que le DO finale _600nm est d'environ 0,1 pour une croissance en phase logarithmique précoce.
2. Diluer la culture de départ en fonction des besoins et repousse 1 ml dans un tube à essai frais supplémentaires 6-8 heures à OD _{600 nm<....}

Résultats

Une expérience réalisée et analysée avec succès donnera série surtout à temps continu pour les cellules entières simples avec réalisme attribué apparition des bourgeons et des temps de division. À titre d'exemple, nous avons réalisé le protocole ci-dessus avec une souche de levure haploïde exprimant une copie intégrée de la protéine fluorescente Cerulean (CFP) entraînée par le promoteur constitutif ADH1 d'observer comment la croissance et l'expression globale peuvent varier au fil du temps .......

Discussion

Le protocole ci-dessus décrit une méthode simple pour obtenir et analyser des données de séries chronologiques de fluorescence avec une expérience limitée en microfluidique ou dans le développement de logiciels. Il permet d'obtenir time-lapse films de fluorescence des cellules de levure simples; extraire la taille des cellules pertinentes et les mesures d'expression; suivi curé et missions de la lignée, et analyser le comportement des cellules entières dans le temps en utilisant un dispositif de culture microflu.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Y04C Plaque de perfusion de levure	CellAsic	Y04C-02
ONIX Plateforme de perfusion microfluidique	CellAsic	EV-262
Axio Observer.Z1 Microscope	Zeiss
Plan-Apochromat 63x/1.40 Huile Objectif DIC	Zeiss	440762-9904-000
Caméra Cascade II EMCCD	Photométrie
Lampe à arc aux halogénures métalliques Lumen 200	PRIOR Scientific
Cube de filtre dichroïque triple-bandelle et ensemble de filtres d’excitation et d’émission	Chroma Technology Corp	set #89006	Utilisé pour YFP (Venus/Citrine), CFP (Cerulean), RFP (mCherry/tdTomato)
Contrôleur MAC 5000 et roues à filtres	Ludl Electronic Products
MATLAB R2011a	Mathworks		La version 64 bits gère mieux les fichiers de données volumineux que la version 32 bits