Het verwerven Fluorescentie Time-lapse films van Budding gist en analyseren van Single-cell Dynamics behulp enten
Summary
We presenteren een eenvoudig protocol voor fluorescentie microscopie films van groeiende gistcellen, en een GUI-gebaseerde software pakket om eencellige tijdreeks gegevens te extraheren verkrijgen. De analyse omvat geautomatiseerde afstamming en verdeeldheid tijd opdracht geïntegreerd met visuele inspectie en handmatige curatie van bijgehouden gegevens.
Abstract
Fluorescentie time-lapse microscopie is uitgegroeid tot een krachtig instrument in de studie van vele biologische processen op het eencellige niveau. In het bijzonder, films beeltenis van de temporele afhankelijkheid van genexpressie geven inzicht in de dynamiek van de regelgeving, maar er zijn veel technische uitdagingen voor het verkrijgen en analyseren van fluorescentie films van enkele cellen. We beschrijven hier een eenvoudig protocol met behulp van een in de handel verkrijgbaar microfluïdische cultuur apparaat om dergelijke gegevens te genereren, en een MATLAB-gebaseerde, grafische gebruikersinterface (GUI)-gebaseerde software pakket om de fluorescentie beelden te kwantificeren. De software segmenten en tracks cellen, kan de gebruiker visueel curator fouten in de gegevens, en wijst geslacht en afdeling tijd uitgevoerd. De GUI analyseert verder de tijdreeks whole cell sporen en hun eerste en tweede afgeleiden produceren. Terwijl de software is ontworpen voor S. cerevisiae, moet zijn modulariteit en veelzijdigheid laat het to dienen als een platform voor het bestuderen van andere celtypes met enkele wijzigingen.
Introduction
Single-cell analyse van genexpressie heeft bevorderd ons begrip van de vele aspecten van genregulatie. Statische momentopnamen van fluorescerende reporter expressie met behulp van flowcytometrie of microscopie nuttige informatie over de verdeling van eencellige expressie, maar missen de geschiedenis en evolutie van tijdreeksen gegevens die nodig zijn om gen-expressie dynamiek rechtstreeks te informeren. Fluorescentie time-lapse microscopie presenteert een middel om zowel single-cell metingen en hun geschiedenis te verkrijgen. Verschillende experimentele en analytische technieken ontwikkeld voor het verkrijgen en kwantificeren films van fluorescente reporter expressie, waardoor meegeven inzichten in genregulatie kenmerken (zie 1 voor een overzicht), zoals cel-cel variaties 2,3, bacteriële persister vorming 4, transcriptie initiatie en rek 5, transcriptie barsten 6,7, cel-cyclus afhankelijkheid 8,9 en erfelijkheid 10. Echter, OBTaining kwaliteit eencellige fluorescentie tijdreeks zijn aanzienlijke technische uitdagingen in kweken van een monolaag van cellen in een controleerbare omgeving en in high-throughput kwantificering van de fluorescentie verkregen films. Hier beschrijven we een procedure voor het verkrijgen en analyseren van fluorescentie films van S. cerevisiae zonder vereiste ervaring in celkweekinrichting vervaardiging of in software ontwikkeling (figuur 1).
Ten eerste, we detail een voorbeeld protocol om fluorescentie tijdreeksen films te genereren voor gist uiten van een of meer fluorescerende reporters. Hoewel op maat microfluïdische cultuur kamers zijn gebouwd en met succes ingezet eerder 11-13, maken we gebruik van een in de handel verkrijgbaar microfluïdische apparaat uit CellAsic (Hayward, CA). Het systeem beperkt cellen monolaag groei en maakt continue controle van de perfusie milieu. De microscopie protocol presenteren we een eenvoudig middel om tl verkrijgenlingen films van gist, maar elke gewijzigde experimentele protocol (een aangepaste cultuur apparaat, alternatieve media omstandigheden, enz.) gelijkblijvende fluorescentie film gegevens van enkele gistcellen kunnen worden vervangen.
Vervolgens schetsen we de analyse van de films met behulp van een grafische gebruikersinterface (GUI)-based softwarepakket in MATLAB (Mathworks, Natick, MA), ook wel de GUI voor snelle analyse van Fluorescentie Time Series (enten), om tijdreeksen gegevens te extraheren voor enkele cellen. Enten heeft dezelfde eigenschappen als de veelzijdige, open-source softwarepakket Cell-ID 14 in het segmenteren en het bijhouden van cellen en in het extraheren van fluorescentie-intensiteit en geometrische informatie. Echter, enten geeft belangrijke aanvullende functies. Ten eerste, het biedt gemakkelijke interactieve bewerking van segmentatie en het bijhouden van de resultaten om de nauwkeurigheid van gegevens, in plaats van alleen statistische venstertijd van uitschieters regio sporen na analyse controleren. Bovendien geldt voor de analyse automatically aanwijzen afkomst en cel-cyclus bezienswaardigheden van gist. Bepalen wanneer moeder en dochter delen om twee onafhankelijke cellen regio's te vormen is cruciaal voor het bepalen van whole cell (moeder met inbegrip van eventuele aangesloten bud) metingen in de hele celcyclus 8. De suite bestaat uit drie modules om deze taken te volbrengen. De eerste segmenten cel regio's op basis van het contrast tussen gericht en ongericht helderveld afbeeldingen en kan de gebruiker segmentatie parameters te definiëren en visueel te testen. De tweede tracks (. Met Blair en Dufresne's MATLAB implementatie van de Crocker et al. IDL routine, beschikbaar op: http://physics.georgetown.edu/MATLAB/ ) en meet cel regio's door de tijd; wijst lineages automatisch, en maakt visuele inspectie en foutcorrectie. Een eenvoudige plotten GUI is opgenomen om een query eencellige eigenschappen. De derde module toeschrijft bud opkomst en divisie times en voert gehele cellen tijdreeksgegevens en hun eerste en tweede afgeleiden (zoals besproken in 9). De analyse module voert de data als een ruimte gescheiden tekstbestand voor verdere studie in de statistische software van keuze. Dus het pakket kan de gebruiker hoge kwaliteit tijdreeksen extraheren via een grafische interface. We hebben deze methode om real-time transcriptiesnelheden schatten enkele gist cellen als functie van de celcyclus 9. Hoewel de modules zijn geoptimaliseerd voor gist, de parameters of, indien nodig, de vrij beschikbare code worden aangepast voor andere organismen en beeldtypen. Segmentatie, tracking, en het geslacht toewijzing algoritmen kan specifiek type beeldvorming toegewezen en de betreffende organisme. De bestaande algoritmes kan worden vervangen, maar nog steeds de GUI interface die gebruiksvriendelijke visuele controle en correctie van segmentatie en het bijhouden van fouten die steevast bedrijfspensioenvoorziening mogelijk maaktr met elk algoritme.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het bovenstaande protocol beschrijft een eenvoudige methode om fluorescentie tijdreeksen gegevens te verkrijgen en te analyseren met een beperkte ervaring in microfluidics of in software ontwikkeling. Het maakt het mogelijk om tijd-vervallen fluorescentie films van enkele gistcellen te verkrijgen; extraheren relevante celgrootte en metingen meningsuiting; kapelaan tracking en lineage opdrachten, en analyseren van het gedrag van de gehele cellen na verloop van tijd met behulp van een in de handel verkrijgbaar microfluïd…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken Emily Jackson, Joshua Zeidman, en Nicholas Wren voor commentaar op de software. Dit werk werd gefinancierd door GM95733 (tot NM), BBBE 103.316 en MIT opstarten van fondsen (tot NM).
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Y04C Yeast Perfusion Plate | CellAsic | Y04C-02 | |
| ONIX Microfluidic Perfusion Platform | CellAsic | EV-262 | |
| Axio Observer.Z1 Microscope | Zeiss | ||
| Plan-Apochromat 63X/1.40 Oil DIC objective | Zeiss | 440762-9904-000 | |
| Cascade II EMCCD camera | Photometrics | ||
| Lumen 200 metal-halide arc lamp | PRIOR Scientific | ||
| Triple-bandpass dichroic filter cube and excitation and emission filter set | Chroma Technology Corp | set #89006 | Used for YFP (Venus/Citrine), CFP (Cerulean), RFP (mCherry/tdTomato) |
| MAC 5000 controller and filter wheels | Ludl Electronic Products | ||
| MATLAB R2011a | Mathworks | 64-bit version handles large data files better than 32-bit |
References
- Locke, J. C. W., Elowitz, M. B. Using movies to analyse gene circuit dynamics in single cells. Nature Reviews. Microbiology. 7 (5), 383-392 (2009).
- Rosenfeld, N., Young, J. W., Alon, U., Swain, P. S., Elowitz, M. B. Gene Regulation at the Single-Cell Level. Science. 307 (5717), 1962-1965 (2005).
- Colman-Lerner, A., Gordon, A., et al. Regulated cell-to-cell variation in a cell-fate decision system. Nature. 437 (7059), 699-706 (2005).
- Vega, N. M., Allison, K. R., Khalil, A. S., Collins, J. J. Signaling-mediated bacterial persister formation. Nature Chemical Biology. 8 (5), 431-433 (2012).
- Larson, D. R., Zenklusen, D., Wu, B., Chao, J. A., Singer, R. H. Real-Time Observation of Transcription Initiation and Elongation on an Endogenous Yeast Gene. Science. 332 (6028), 475-478 (2011).
- Golding, I., Paulsson, J., Zawilski, S., Cox, E. Real-time kinetics of gene activity in individual bacteria. Cell. 123 (6), 1025-1061 (2005).
- Suter, D. M., Molina, N., Gatfield, D., Schneider, K., Schibler, U., Naef, F. Mammalian Genes Are Transcribed with Widely Different Bursting Kinetics. Science. 332 (6028), 472-474 (2011).
- Cookson, N. A., Cookson, S. W., Tsimring, L. S., Hasty, J. Cell cycle-dependent variations in protein concentration. Nucleic Acids Research. 38 (8), 2676-2681 (2010).
- Zopf, C. J., Quinn, K., Zeidman, J., Maheshri, N. Cell-cycle dependence of transcription dominates noise in gene expression. , (2013).
- Kaufmann, B. B., Yang, Q., Mettetal, J. T., Van Oudenaarden, A. Heritable stochastic switching revealed by single-cell genealogy. PLoS Biology. 5 (9), e239 (2007).
- Cookson, S., Ostroff, N., Pang, W. L., Volfson, D., Hasty, J. Monitoring dynamics of single-cell gene expression over multiple cell cycles. Molecular Systems Biology. 1 (1), 2005.0024 (2005).
- Paliwal, S., Iglesias, P. A., Campbell, K., Hilioti, Z., Groisman, A., Levchenko, A. MAPK-mediated bimodal gene expression and adaptive gradient sensing in yeast. Nature. 446 (7131), 46-51 (2007).
- Charvin, G., Cross, F. R., Siggia, E. D. A microfluidic device for temporally controlled gene expression and long-term fluorescent imaging in unperturbed dividing yeast cells. PloS One. 3 (1), e1468 (2008).
- Gordon, A., Colman-Lerner, A., Chin, T. E., Benjamin, K. R., Yu, R. C., Brent, R. Single-cell quantification of molecules and rates using open-source microscope-based cytometry. Nat. Meth. 4 (2), 175-181 (2007).
- Otsu, N. A Threshold Selection Method from Gray-Level Histograms. IEEE Trans. Sys. Man. Cyber. 9 (1), 62-66 (1979).
- Goranov, A. I., Cook, M., et al. The rate of cell growth is governed by cell cycle stage. Genes & Development. 23 (12), 1408-1422 (2009).
- To, T. -. L., Maheshri, N. Noise Can Induce Bimodality in Positive Transcriptional Feedback Loops Without Bistability. Science. 327 (5969), 1142-1145 (2010).
- O’Neill, E. M., Kaffman, A., Jolly, E. R., O’Shea, E. K. Regulation of PHO4 nuclear localization by the PHO80-PHO85 cyclin-CDK complex. Science. 271 (5246), 209-212 (1996).
- Raser, J. M., O’Shea, E. K. Control of stochasticity in eukaryotic gene expression. Science. 304 (5678), 1811-1814 (2004).
