La adquisición de fluorescencia Time-lapse películas de levadura en ciernes y el análisis de la dinámica de una sola célula con injertos

Summary

Se presenta un protocolo sencillo para obtener películas de microscopía de fluorescencia de las células de levadura en crecimiento, y un paquete de software basado en GUI para extraer los datos de series de tiempo de una sola célula. El análisis incluye linaje automático y la asignación por división de tiempo integrado con inspección visual y manual de conservación de los datos de seguimiento.

Abstract

Microscopía de fluorescencia de lapso de tiempo se ha convertido en una herramienta poderosa en el estudio de muchos procesos biológicos a nivel de una sola célula. En particular, las películas que representan la dependencia temporal de la expresión génica dar una idea de la dinámica de su regulación, sin embargo, hay muchos desafíos técnicos para la obtención y el análisis de las películas de fluorescencia de las células individuales. Se describe aquí un protocolo simple utilizando un dispositivo de cultivo de microfluidos disponibles comercialmente para generar dichos datos, y una interfaz basada en MATLAB gráfica de usuario (GUI) basada en paquete de software para cuantificar las imágenes de fluorescencia. Los segmentos de software y células pistas, permite al usuario vicario visualmente errores en los datos, y asigna automáticamente linaje y tiempos de división. La interfaz gráfica de usuario analiza aún más la serie de tiempo para producir trazas de células enteras, así como sus derivados primero y segundo tiempo. Mientras que el software fue diseñado para S. cerevisiae, su modularidad y versatilidad deben permitir que to Servir como plataforma para el estudio de otros tipos de células, con algunas modificaciones.

Introduction

Análisis individual de células de la expresión génica ha impulsado nuestra comprensión de muchos aspectos de la regulación de genes. Instantáneas estáticas de expresión reportero fluorescente utilizando citometría de flujo o microscopía proporcionan información útil sobre la distribución de la expresión de una sola célula, pero carecen de la historia y la evolución de los datos de series de tiempo requeridos para informar directamente dinámica de la expresión de genes. Fluorescencia microscopía de lapso de tiempo presenta un medio para obtener ambas medidas unicelulares y su historia. Diversas técnicas experimentales y analíticos se han desarrollado para obtener y cuantificar las películas de la expresión del indicador fluorescente, impartiendo así conocimientos sobre las características de regulación génica (véase ¹ para una revisión), como la variación de célula a célula de ^2,3, la formación persister bacteriana ^4, la transcripción iniciación y elongación de ^5, transcripción estallido ^6,7, la dependencia del ciclo celular ^8,9, y la heredabilidad ^10. Sin embargo, obtaining series de tiempo de fluorescencia de una sola célula de calidad implica retos técnicos significativos en el cultivo de una monocapa de células en un entorno controlable y en la cuantificación de alto rendimiento de las películas de fluorescencia adquiridos. Aquí se describe un procedimiento para obtener y analizar películas de fluorescencia de S. cerevisiae sin experiencia requerida en la cultura fabricación dispositivo celular o en el desarrollo de software (Figura 1).

En primer lugar, vamos a detallar un protocolo de ejemplo para generar fluorescencia películas de series de tiempo para la levadura en ciernes que expresa una o más reporteros fluorescentes. Aunque cámaras de cultivo de microfluidos personalizadas se han construido y empleado con éxito previamente ^11-13, se utiliza un dispositivo de microfluidos disponible comercialmente de CellAsic (Hayward, CA). El sistema confina a las células de crecimiento monocapa y permite el control continuo de la perfusión del medio ambiente. El protocolo de microscopía que presentamos es un simple medio para obtener fluorescpelículas rencia de levadura en ciernes, pero cualquier modificación del protocolo experimental (un dispositivo de cultivo a medida, las condiciones de los medios de comunicación alternativos, etc.) que producen datos de la película de fluorescencia similares de células individuales de levadura pueden ser sustituidos.

A continuación, presentamos el análisis de las películas mediante una interfaz gráfica de usuario (GUI) basada en software de MATLAB (Mathworks, Natick, MA), conocido como el GUI para Rapid Analysis of Time Series fluorescencia (INJERTOS), para extraer los datos de series de tiempo para las células individuales. INJERTOS tiene características similares al versátil software de código abierto paquete identificador de celda ¹⁴ en la segmentación y seguimiento de las células y en la extracción de la intensidad de fluorescencia y la información geométrica. Sin embargo, los injertos ofrece importantes características adicionales. En primer lugar, ofrece una fácil edición interactiva de segmentación y seguimiento de los resultados para comprobar la precisión de datos, en lugar de gating estadística de valores atípicos huellas región tras el análisis. Por otra parte, se extiende el análisis a automatically designado linaje y puntos del ciclo celular de interés de la levadura en ciernes. La determinación de cuando la madre y la hija se dividen para formar dos regiones independientes de células es crucial para la determinación de células enteras (incluyendo cualquier madre brote conectado) mediciones en todo el ciclo celular ^8. La suite consta de tres módulos para realizar estas tareas. Las primeras regiones celulares segmentos basados ​​en el contraste entre las imágenes de campo claro enfocadas y desenfocadas, y permite al usuario definir y visualmente comprobar los parámetros de segmentación. El segundo pistas (. Utilizando Blair y ejecución MATLAB del Crocker et al IDL rutina de Dufresne, disponible en: http://physics.georgetown.edu/MATLAB/ ) y medidas de las regiones celulares a través del tiempo; asigna automáticamente linajes, y permite la inspección visual y corrección de errores. Una sencilla interfaz gráfica de usuario trazado se incluye a las propiedades de una sola célula de la consulta. El tercer módulo atribuye la yema aparición y división times, y da salida a datos de series temporales de células enteras, así como sus derivados primero y segundo de tiempo (como se discute en ^9). El módulo de análisis da salida a los datos como un archivo de texto delimitado por espacios para estudio posterior en el software estadístico de elección. Por lo tanto, el paquete permite al usuario extraer datos de series temporales de alta calidad a través de una interfaz gráfica. Hemos utilizado este método para estimar las tasas de transcripción en tiempo real en células de levadura en ciernes individuales como una función del ciclo celular ^9. Mientras que los módulos han sido optimizados para la levadura en ciernes, los parámetros o, si es necesario, el código libremente disponible se puede adaptar para otros organismos y tipos de imágenes. Segmentación, seguimiento, y el linaje algoritmos de asignación pueden ser específicos de los tipos de imagen afectados y el organismo en cuestión. Los algoritmos existentes podrían ser reemplazados, pero todavía conservan la interfaz gráfica de usuario que permite la inspección visual fácil de usar y corrección de errores de segmentación y de seguimiento que invariablemente ocupantesr con cualquier algoritmo.

Protocol

1. Obtener fluorescentes Microscopía Películas de células individuales de levadura que crece en una Cámara Microfluidic Inocular 1 ml de medio SC (medios definidos sintéticos con 2% de glucosa y el complemento completo de aminoácidos) con células de una placa recién creciente, y se incuba el cultivo durante la noche ~ 16 horas sobre un tambor de rodillo a 30 ° C. Preparar la cultura de modo que la final OD 600 nm es de ~ 0,1 para el crecimiento en fase logarítmica temprana. Dilu…

Representative Results

Un experimento llevado a cabo con éxito y analizado producirá series de tiempo sobre todo continua de células enteras individuales con realismo asignado aparición del brote y los tiempos de división. Como un ejemplo, se realizó el protocolo anterior con una cepa de levadura haploide que expresa una copia integrada de la proteína fluorescente Cerulean (PPC) impulsado por el promotor ADH1 constitutivo de observar cómo el crecimiento y la expresión global pueden variar con el tiempo en las célul…

Discussion

El protocolo anterior se describe un método simple para obtener y analizar datos de series temporales de fluorescencia con experiencia limitada en la microfluídica o en el desarrollo de software. Esto permite obtener películas a intervalos de fluorescencia de las células individuales de levadura, extracto de tamaño de la celda correspondiente y las mediciones de expresión; asignaciones linaje cura y seguimiento, y analizar el comportamiento de las células en su conjunto a través del tiempo mediante un dispositiv…

Materials

Name of Reagent/Material	Company	Catalog Number	Comments
Y04C Yeast Perfusion Plate	CellAsic	Y04C-02
ONIX Microfluidic Perfusion Platform	CellAsic	EV-262
Axio Observer.Z1 Microscope	Zeiss
Plan-Apochromat 63X/1.40 Oil DIC objective	Zeiss	440762-9904-000
Cascade II EMCCD camera	Photometrics
Lumen 200 metal-halide arc lamp	PRIOR Scientific
Triple-bandpass dichroic filter cube and excitation and emission filter set	Chroma Technology Corp	set #89006	Used for YFP (Venus/Citrine), CFP (Cerulean), RFP (mCherry/tdTomato)
MAC 5000 controller and filter wheels	Ludl Electronic Products
MATLAB R2011a	Mathworks		64-bit version handles large data files better than 32-bit