Tomurcuklanma Maya Floresan Time-lapse Filmler Kazanılması ve GREFTLERİ kullanarak Tek hücreli Dynamics analiz
Summary
Biz floresan büyüyen maya hücreleri mikroskop film ve tek hücreli zaman serisi veri ayıklamak için bir GUI tabanlı yazılım paketi elde etmek için basit protokol mevcut. Analizi otomatik soy ve görsel denetim ve izlenen verileri manuel küratörlüğü ile entegre bölümü zaman atama içerir.
Abstract
Floresan zaman atlamalı mikroskopi tek hücre düzeyinde birçok biyolojik süreçlerin çalışmada güçlü bir araç haline gelmiştir. Özellikle, gen ifadesinin zamansal bağımlılığı gösteren film kendi düzenleme dinamikleri ilişkin bilgi sağlar, ancak tek hücre floresan film elde ve analiz için birçok teknik zorluklar vardır. Biz burada bu tür veri oluşturmak için ticari olarak satılan mikroakışkan kültür cihaz kullanarak basit bir protokol ve bir MATLAB tabanlı, grafik kullanıcı arayüzü (GUI) tabanlı yazılım paketi floresan görüntüleri ölçmek için açıklar. Yazılım bölümleri ve parça hücreleri kullanıcı görsel veri hataları barındırmalarına sağlar, ve otomatik olarak soy ve bölme kez atar. GUI daha bütün bir hücre izleri yanı sıra birinci ve ikinci zaman türevleri üretmek için zaman serisi analiz eder. Yazılım S. tasarlanmış iken cerevisiae, modülerlik ve çok yönlü t izin vermelidirbirkaç değişiklik ile diğer hücre tipleri eğitim için bir platform olarak hizmet o.
Introduction
Gen Tek hücre analizi gen regülasyonu birçok açıdan bizim anlaşılmasını kolaylaştırdı. Akım sitometri veya mikroskopi kullanılarak floresan muhabiri ifade statik anlık tek hücreli ifade dağılımı hakkında yararlı bilgiler sağlar, ancak tarih ve doğrudan gen dinamikleri bilgilendirmek için gerekli zaman serisi verileri evrimi eksikliği. Floresan zaman atlamalı mikroskopi tek hücreli ölçümleri ve tarih hem de elde etmek için bir araç sunar. Çeşitli deneysel ve analitik teknikler böylece, hücre-hücre varyasyon 2,3, bakteriyel persister oluşumu 4, transkripsiyon gibi gen regülasyonu özellikleri içine anlayışlar (bir yorum için 1) aktarmanın, floresan muhabiri ifade film elde etmek ve ölçmek için geliştirilmiştir başlatılması ve uzama 5, 6,7 patlama transkripsiyonel, hücre döngüsü bağımlılık 8,9, ve kalıtım 10. Bununla birlikte, OBT'ninAining kaliteli tek hücreli floresan zaman serisi kültür önemli teknik sorunlar kontrol edilebilir bir ortam ve elde edilen floresan filmleri yüksek verimli miktarının bir hücre tek tabaka içerir. Burada, S. floresan film elde etmek ve analiz etmek için bir prosedür tarif hücre kültürü cihaz üretiminde veya yazılım geliştirme hiç gerekli deneyimi (Şekil 1) ile cerevisiae.
İlk olarak, ayrıntılı bir örnek protokolü bir veya daha fazla floresan gazetecilere ifade tomurcuklanan maya için floresan zaman serisi film oluşturmak için. Özel mikroakışkan kültür odaları inşa edilmiş ve başarılı bir şekilde daha önce 11-13 istihdam edilmiştir rağmen, biz CellAsic (Hayward, CA) bir ticari mikroakışkan cihazı kullanın. Sistem, tek tabaka sınırları büyüme hücreleri ve perfüzyon ortamının sürekli olarak kontrol edilmesini sağlar. Biz mevcut mikroskopi protokolü fluoresc elde etmek için basit bir araçtırence tomurcuklanan maya film, ancak herhangi bir değişiklik deney protokolünde (özelleştirilmiş bir kültür cihaz, alternatif medya koşulları, vb.) tek maya hücrelerinin benzer floresan film veri verimli ikame edilebilir.
Sonra, zaman serisi veri ayıklamak için bir grafik kullanıcı arayüzü (GUI) tabanlı MATLAB yazılım paketi (Mathworks, Natick, MA), Floresans Zaman Serisi Hızlı Analizi (GREFTLERİ) için GUI adlandırılan, kullanarak filmlerin analizi anahat tek hücreler için. GREFTLERİ hücreleri segmentlere ve izleme ve floresan ve geometrik bilgileri ayıklamak en çok yönlü, açık kaynak yazılım paketi Hücre-ID 14 benzer özelliklere sahiptir. Ancak, GREFTLERİ önemli ek özellikler sağlar. İlk olarak, segmentasyon ve veri doğruluğunu, yerine analizden sonra aykırı bölge izleri sadece istatistiksel yolluk doğrulamak için izleme sonuçlarının kolay interaktif düzenleme sunmaktadır. Ayrıca, automaticall için analizi uzanıry adayı soy ve tomurcuklanan maya ilgi hücre döngüsü noktaları. Anne ve kızı iki bağımsız hücre bölge oluşturmak için bölmek zamanını belirleme tüm hücre (herhangi bir bağlı tomurcuk gibi anne) hücre döngüsü 8 boyunca ölçümleri belirlemek için çok önemlidir. Suite bu görevleri yerine getirmek için üç modülden oluşmaktadır. Odaklı ve odaklanmamış parlak bir alan görüntüler arasında kontrast dayanan ve ilk bölümleri hücre bölgeleri kullanıcı segmentasyonu parametrelerini tanımlamak ve görsel olarak test etmenizi sağlar. İkinci (. Mevcut Blair ve Crocker ve ark IDL rutin Dufresne'nin MATLAB uygulaması kullanarak,: parça http://physics.georgetown.edu/MATLAB/ ) ve zaman içinde hücre bölgelerde önlemler; otomatik soy atar ve görsel denetim sağlar ve hata düzeltme. Basit bir komplo GUI sorgu tek hücreli özelliklerine dahildir. Üçüncü modül tomurcuk ortaya çıkması ve bölme ti bağlıyormes, ve tüm hücre zaman serisi verilerin yanı sıra ilk ve ikinci kez türevleri (as 9 ele) verir. Analiz modülü tercih istatistiksel yazılım sonraki çalışma için bir boşluk ayrılmış metin dosyası olarak veri verir. Böylece paketi kullanıcı bir grafik arayüz üzerinden yüksek kaliteli zaman serisi veri ayıklamak sağlar. Biz hücre döngüsü 9 bir fonksiyonu olarak tek tomurcuklanan maya hücreleri gerçek zamanlı transkripsiyon oranları tahmin etmek için bu yöntemi kullandık. Modüllerin tomurcuklanma maya, parametreleri veya için optimize edilmiş olsa da, gerekirse, serbestçe kullanılabilir kod diğer organizmalar ve resim tipleri için adapte edilebilir. Segmentasyon, izleme, ve soy atama algoritmaları atanan görüntüleme ve söz konusu organizmanın türlerine özgü olabilir. Mevcut algoritmaları yerine, ama yine de kullanıcı dostu görsel denetim ve segmentasyon düzeltme ve her zaman istediğimiz an izleme hataları sağlar GUI arayüzü korumak olabilirherhangi bir algoritma ile r.
Protocol
Representative Results
Discussion
Yukarıdaki protokol Mikroakiskan veya yazılım geliştirme sınırlı deneyimi olan floresan zaman serisi verileri elde etmek ve analiz etmek için basit bir yöntem açıklanır. Bu tek bir maya hücrelerinin zaman sukut floresan film elde etmesini sağlar, papaz izleme ve soy atamaları,, ilgili hücre boyutu ve ifade ölçümleri ayıklamak ve bir ticari mikroakışkan kültür cihaz kullanarak zaman ve çok yönlü bir grafik kullanıcı üzerinde bütün hücrelerin davranışını analiz arayüzü (GUI). Deneyse…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz yazılım yapılan yorumlar için Emily Jackson, Joshua Zeidman ve Nicholas Wren teşekkür ederim. Bu çalışma GM95733 (NM için), BBBE 103316 ve MIT başlangıç fonları (NM için) tarafından finanse edildi.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Y04C Yeast Perfusion Plate | CellAsic | Y04C-02 | |
| ONIX Microfluidic Perfusion Platform | CellAsic | EV-262 | |
| Axio Observer.Z1 Microscope | Zeiss | ||
| Plan-Apochromat 63X/1.40 Oil DIC objective | Zeiss | 440762-9904-000 | |
| Cascade II EMCCD camera | Photometrics | ||
| Lumen 200 metal-halide arc lamp | PRIOR Scientific | ||
| Triple-bandpass dichroic filter cube and excitation and emission filter set | Chroma Technology Corp | set #89006 | Used for YFP (Venus/Citrine), CFP (Cerulean), RFP (mCherry/tdTomato) |
| MAC 5000 controller and filter wheels | Ludl Electronic Products | ||
| MATLAB R2011a | Mathworks | 64-bit version handles large data files better than 32-bit |
References
- Locke, J. C. W., Elowitz, M. B. Using movies to analyse gene circuit dynamics in single cells. Nature Reviews. Microbiology. 7 (5), 383-392 (2009).
- Rosenfeld, N., Young, J. W., Alon, U., Swain, P. S., Elowitz, M. B. Gene Regulation at the Single-Cell Level. Science. 307 (5717), 1962-1965 (2005).
- Colman-Lerner, A., Gordon, A., et al. Regulated cell-to-cell variation in a cell-fate decision system. Nature. 437 (7059), 699-706 (2005).
- Vega, N. M., Allison, K. R., Khalil, A. S., Collins, J. J. Signaling-mediated bacterial persister formation. Nature Chemical Biology. 8 (5), 431-433 (2012).
- Larson, D. R., Zenklusen, D., Wu, B., Chao, J. A., Singer, R. H. Real-Time Observation of Transcription Initiation and Elongation on an Endogenous Yeast Gene. Science. 332 (6028), 475-478 (2011).
- Golding, I., Paulsson, J., Zawilski, S., Cox, E. Real-time kinetics of gene activity in individual bacteria. Cell. 123 (6), 1025-1061 (2005).
- Suter, D. M., Molina, N., Gatfield, D., Schneider, K., Schibler, U., Naef, F. Mammalian Genes Are Transcribed with Widely Different Bursting Kinetics. Science. 332 (6028), 472-474 (2011).
- Cookson, N. A., Cookson, S. W., Tsimring, L. S., Hasty, J. Cell cycle-dependent variations in protein concentration. Nucleic Acids Research. 38 (8), 2676-2681 (2010).
- Zopf, C. J., Quinn, K., Zeidman, J., Maheshri, N. Cell-cycle dependence of transcription dominates noise in gene expression. , (2013).
- Kaufmann, B. B., Yang, Q., Mettetal, J. T., Van Oudenaarden, A. Heritable stochastic switching revealed by single-cell genealogy. PLoS Biology. 5 (9), e239 (2007).
- Cookson, S., Ostroff, N., Pang, W. L., Volfson, D., Hasty, J. Monitoring dynamics of single-cell gene expression over multiple cell cycles. Molecular Systems Biology. 1 (1), 2005.0024 (2005).
- Paliwal, S., Iglesias, P. A., Campbell, K., Hilioti, Z., Groisman, A., Levchenko, A. MAPK-mediated bimodal gene expression and adaptive gradient sensing in yeast. Nature. 446 (7131), 46-51 (2007).
- Charvin, G., Cross, F. R., Siggia, E. D. A microfluidic device for temporally controlled gene expression and long-term fluorescent imaging in unperturbed dividing yeast cells. PloS One. 3 (1), e1468 (2008).
- Gordon, A., Colman-Lerner, A., Chin, T. E., Benjamin, K. R., Yu, R. C., Brent, R. Single-cell quantification of molecules and rates using open-source microscope-based cytometry. Nat. Meth. 4 (2), 175-181 (2007).
- Otsu, N. A Threshold Selection Method from Gray-Level Histograms. IEEE Trans. Sys. Man. Cyber. 9 (1), 62-66 (1979).
- Goranov, A. I., Cook, M., et al. The rate of cell growth is governed by cell cycle stage. Genes & Development. 23 (12), 1408-1422 (2009).
- To, T. -. L., Maheshri, N. Noise Can Induce Bimodality in Positive Transcriptional Feedback Loops Without Bistability. Science. 327 (5969), 1142-1145 (2010).
- O’Neill, E. M., Kaffman, A., Jolly, E. R., O’Shea, E. K. Regulation of PHO4 nuclear localization by the PHO80-PHO85 cyclin-CDK complex. Science. 271 (5246), 209-212 (1996).
- Raser, J. M., O’Shea, E. K. Control of stochasticity in eukaryotic gene expression. Science. 304 (5678), 1811-1814 (2004).
