Sono descritti metodi per creare tessuti tumorali 3D umani come sistemi di test. Queste tecnologie si basano su un decellularized biologica vascolarizzato impalcatura (BioVaSc), cellule umane primarie e una linea di cellule tumorali, che possono essere coltivate in condizioni statiche e in condizioni dinamiche in un bioreattore flusso.
Il cancro è una delle principali cause di morte nel mondo. Strategie terapeutiche attuali sono prevalentemente sviluppate in sistemi di coltura 2D, che riflettono adeguatamente le condizioni fisiologiche in vivo. Matrici biologiche 3D forniscono cellule un ambiente in cui le cellule possono auto-organizzarsi, permettendo lo studio dell'organizzazione dei tessuti e la differenziazione cellulare. Tali ponteggi possono essere seminati con una miscela di diversi tipi di cellule per studiare cellula-cellula-interazioni dirette 3D. Per simulare la complessità 3D dei tumori del cancro, il nostro gruppo ha sviluppato un sistema di test 3D in vitro del tumore.
I nostri modelli 3D sistema di test tessuto la situazione in vivo di tumori maligni dei nervi periferici guaina (MPNSTs), che abbiamo instaurato con la nostra decellularized suina segmento digiunale derivata scaffold vascolarizzato biologico (BioVaSc). Nel nostro modello, abbiamo reseeded una matrice BioVaSc modificato con fibroblasti, cellule endoteliali microvascolari (mvECs) e la linea cellulare tumorale S462. Per la cultura statica, la struttura vascolare del BioVaSc viene rimosso e l'impalcatura rimanente viene tagliato aperto su un lato (Small Intestinal Sottomucosa SIS-MUC). La matrice risultante viene poi fissato tra due anelli in metallo (corone cellulari).
Un'altra opzione è quella di coltura la cellula-seminato SIS-Muc in un sistema di bioreattore flusso che espone le cellule a sollecitazioni di taglio. Qui, il bioreattore è collegato ad una pompa peristaltica in un incubatore autocostruito. Un computer regola l'ossigeno arterioso e di nutrienti attraverso parametri come la pressione sanguigna, temperatura e portata. Questa configurazione consente una cultura dinamica sia con pulsatile-regolato pressione o flusso costante.
In questo studio, abbiamo potuto stabilire con successo sia un sistema di coltura 3D statico e dinamico per MPNSTs. La capacità di modellare i tumori del cancro in un ambiente più naturale 3D consentirà la scoperta, la sperimentazione e la validazione difuturi farmaci in un modello umano-simili.
Nuovi farmaci devono essere validati in relazione alla loro qualità, sicurezza ed efficacia prima autorizzazione alla commercializzazione. Ad oggi, la sperimentazione animale sono il metodo standard per droga test e validazione. Tuttavia, a causa delle differenze specie-specifici, esperimenti sugli animali spesso non globalmente valutare l'effetto dei composti nell'uomo 1. Per questa ragione, è importante generare modelli di tessuto umano che possono essere utilizzati per le prove in vitro di nuovi farmaci e sostanze.
Uno dei punti focali del nostro gruppo è la creazione di modelli in vitro test con il nostro scaffold vascolarizzato biologica (BioVaSc) 2,3. Il BioVaSc può essere utilizzato come un sistema a matrice 3D statico o dinamico. Per la cultura statica, il porcino segmento digiunale decellularized (Small intestinale Sottomucosa SIS-Muc) è collocato in un inserto in metallo per la risemina delle cellule. Varie cellule, come il cancro e cellule endoteliali possono essere coltivate sulla forca.
<pclass = "jove_content"> Per cultura dinamica, il BioVaSc è collegato a un sistema di bioreattore che si applica in tutto il flusso vascolare o sulla superficie del ponteggio. Bioreattori attuali implementano stimoli biologici, meccanici o elettrici che agiscono sulla differenziazione o proliferazione di cellule 4. Per bioreattori nel campo della Tissue Engineering, il concetto di base è di simulare le condizioni nel corpo umano. In cui, le cellule sono ottenute un ambiente naturale in cui possono interagire tra loro e la loro matrice extracellulare circostante. Per la produzione di sistemi o trapianti di test in vitro, la capacità di mimare l'ambiente naturale delle cellule con una struttura portante appropriata e sistema di bioreattore è critica 5. Pertanto, i dispositivi più complessi e tecnicamente impegnative devono essere sviluppati al fine di adempiere a tali compiti 6.E 'inoltre possibile utilizzare scaffold per la establishment di un modello vascolarizzato causa delle strutture tubolari conservati, che includono l'arteria alimentazione, vena, e il letto capillare collegamento. Tutte le cellule suina devono essere rimossi da decellularization chimica, meccanica ed enzimatica, e l'impalcatura gamma-sterilizzato. Le strutture vascolari tubolari restaurati possono essere successivamente reseeded con le cellule endoteliali microvascolari umane usando un ricircolo perfusione bioreattore 7, che imita i parametri biomeccanici e / o biochimici come pH, temperatura, pressione, apporto di sostanze nutritive e la rimozione dei rifiuti 6. La ri-endotelizzazione delle strutture tubolari crea un equivalente umano all'interno del vaso sanguigno scaffold 3,7 collagene. Nella fase successiva, la superficie degli ex lumen (mucosa) può essere seminato con cellule umane primarie per stabilire co-culture 3,7,8.
In questo studio un sistema di test tumore 3D è impostato mediante co-coltura di una linea cellulare di tumore primario stcellule Romal in condizioni statiche e dinamiche sul SIS-Muc.
Quando si confrontano i sistemi di coltura 2D e 3D nella ricerca del tumore, sistemi 3D, pur essendo il metodo più costoso, hanno dimostrato di simulare le condizioni di microambienti biologiche meglio. È stato dimostrato che alcune cellule tumorali crescono molto più lento in una cultura 3D che in una cultura 2D comune 12, che è in accordo con la situazione in un vero tumore. Bissell e collaboratori hanno dimostrato nel loro lavoro che il comportamento delle cellule mammarie cancerogene riflette la situazione in vivo, compresi morfologia e segnalazione cellulare, più precisamente quando una cultura 3D all'interno di una matrice offre interazioni cellula-ECM. Inoltre, hanno sottolineato l'importanza dell'ambiente extracellulare in 3D dimostrando che cambiamenti nelle interazioni ambientali hanno portato alla reversione delle cellule maligne ad un fenotipo normale. Inoltre, e cosa più importante, questi risultati potrebbero anche essere confermate de modelli animali in vivo 10,11.
ONTENUTO "> Il confronto diretto di esperimenti in vivo e de modelli animali in vitro di tessuto rivela vantaggi e svantaggi in entrambi i sistemi. Un vantaggio di modelli in vitro è l'autorizzazione di una migliore tempo reale o immagini fisse mediante microscopia. Una limitazione è che imitano condizioni statiche o di breve durata, mentre i sistemi in vivo spesso progrediscono. L'attuale mancanza di vascolarizzazione e normale trasporto di piccole molecole, ospiterà le risposte immunitarie, e altre interazioni cellula-cellula sono ulteriori svantaggi dei modelli in vitro 12. Pertanto, 3D sistemi in vitro, come presentato in questo studio offrono una promettente Oltre alla sperimentazione animale. Essi forniscono una migliore comparabilità per l'organismo umano e quindi ridurre al minimo fraintendimenti sperimentali. Biomimetic de sistemi modello in vivo sarà quindi diventerà più rilevante per studiare come il cancro e la diffusione metastatica dipende sulle condizioni microambientali che regolano tumorigenesis 11.Il nostro studio mostra che l'ambiente 3D fornito dal SIS-MUC porta ad una maggiore formazione di tessuto tumorale della cellule, che non si osserva nella cultura comune cella 2D (Figura 3A). Inoltre, l'uso di cellule primarie derivate da biopsie tumorali è un passo molto importante verso medicina personale, una disciplina che mira ad individuare il miglior trattamento a seconda delle esigenze individuali del paziente. Incorporando cellule tumorali paziente-specifiche primari isolati da materiale bioptico consentirà di sperimentazione in vitro di strategie terapeutiche. Tali sistemi di test consentiranno di indagare diversi farmaci e loro combinazioni in un tempo e high-throughput screening di risparmio di costi. Inoltre, l'integrazione di cellule stromali del tumore-associato, come mostrato in questo studio è importante per l'approccio personalizzato, poiché progressione influenze microambiente del tumore tumore 13 e potrebbe rivelarsi come AdattaLe obiettivo terapeutico.
In alternativa ad un approccio personalizzato, il nostro modello di tumore può essere modificato per servire come sistema di test tumore generalizzato dall'incorporazione di linee cellulari tumorali stabiliti. Questo è un adattamento promettente per scopi di ricerca di base. Per entrambi droga test avvicina alla presenza di una struttura vascolare è richiesto di verificare la distribuzione e l'assorbimento delle sostanze terapeutiche. La matrice SIS-Muc permette la semina basolaterale con primario MVEC per gli studi barriera di assorbimento, la risemina delle strutture vascolari conservati della BioVaSc migliorerà ulteriormente lo studio della consegna della droga.
Al fine di creare modelli di tessuto, una matrice biodegradabile 3D può essere utilizzato come struttura per una co-coltura di diversi tipi di cellule 14. L'uso di tali matrici 3D è spesso limitato dalla mancanza di vascolarizzazione funzionale. Questo problema può essere risolto con l'uso del BioVaSc, che offre conservato str vaso sanguignoutture, che può essere reseeded con le cellule endoteliali. Inoltre, il BioVaSc fornisce componenti extracellulari, che garantiscono l'adesione delle cellule e facilitano la differenziazione dei tessuti. Esso consente anche la funzione specifica del tessuto di lunga data di tessuti 3D bioartificiali 7,8,15. Il presupposto per l'ingegneria dei sostituti vascolari funzionali è il mimetismo della fisiologica umana e delle condizioni biomeccaniche. Pertanto, bioreattori, che possono implementare questi requisiti in vitro, sono di estremo interesse per la creazione di modelli tumorali biologici.
La combinazione del BioVaSc, la tecnologia bioreattore e co-coltura di diversi tipi di cellule è un metodo molto promettente per generare tessuti tumorali vascolarizzati, che permetteranno lo studio dei meccanismi rilevanti per la progressione del cancro come angiogenesi e metastasi. Vediamo tali modelli tumorali come un approccio promettente per integrare gli studi sugli animali, fornendo un equivalentealla fisiologia tumore umano.
The authors have nothing to disclose.
Gli autori desiderano ringraziare Jan Hansmann (Fraunhofer IGB, Stuttgart) per il suo supporto tecnico per sviluppare bioreattori e l'incubatrice bioreattore.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
Collagenase solution | SERVA | 17454 | (500 U/ml) |
Dispase solution | Gibco | 17105-041 | (2.0 U/ml) |
DMEM, high-glucose | PAA | G0001,3010 | |
DNase | ROCHE | 10104159001 | 200 mg solved in 500 ml PBS+ + 1% PenStrep |
DZ solution | Roth | 3484.2 | 34 g Sodium Desoxychelate, in 1 L Ultra-pure water |
FCS | LONZA | DE14-801F | |
IHC-Kit DCS SuperVision 2 HRP | DCS | PD000KIT | |
medical pressure transducer | MEMSCAP | SP844 | |
monoclonal mouse anti-human Von Willebrand Factor | DAKO Cytomation | M0616 | Clone F8/86 0.12 μg/ml |
mouse monoclonal anti-human p53 | DAKO Cytomation | IS616 | Clone DO-7 ready-to-use |
peristaltic pump | Ismatec | ||
sterile disposable dome | MEMSCAP | 844-28 | |
Trypsin / EDTA solution | PAA | L11-003 | 0,05% |
VascuLife (VEGF-Mv) | Lifeline | LL-0003 | |
Versene | Gibco | 15040-033 |