試験系として、ヒトの3D腫瘍組織を作成するための方法が記載されている。これらの技術は、脱細胞化生体血管柄足場(BioVaSc)、初代ヒト細胞およびフローバイオリアクターにおける動的条件下で、ならびに、静的条件下で培養することができる腫瘍細胞株に基づいている。
がんは、世界中の主要な死亡原因の一つである。現在の治療戦略は、主に不十分なin vivoでの生理的条件を反映した2次元培養系で開発されています。生物学的な3Dマトリックスは、組織の組織および細胞分化の研究を可能にする、細胞に細胞が自己組織化することができる環境を提供する。そのような足場は、直接3D細胞 – 細胞相互作用を研究するために、異なる細胞型の混合物を用いて播種することができる。癌腫瘍の3次元の複雑さを模倣するために、我々のグループは、3D in vitroでの腫瘍のテストシステムを開発しました。
我々の3D組織検査システムモデル我々は、生物学的に血管新生足場(BioVaSc)由来の我々の脱細胞化ブタの空腸セグメントとの間で確立悪性末梢神経鞘腫瘍(MPNSTs) のin vivoの状況。我々のモデルでは、初代線維芽細胞、微小血管内皮細胞(BioVaScで修飾マトリックスを再播種低継代数のMVEC)およびS462の腫瘍細胞株。静置培養のために、BioVaScの血管構造が除去され、残りの足場は1辺(小腸粘膜下組織SIS-MUC)に切り開かれている。得られたマトリックスは、2つの金属リング(セル冠)との間に固定されている。
別のオプションは、せん断応力に細胞を公開するフローバイオリアクターシステムで培養するために細胞を播種し、SIS-MUCです。ここで、バイオリアクターは、自己構築インキュベーター内蠕動ポンプに接続されている。コンピュータは、例えば、血圧、温度、流量などのパラメータを介して、動脈酸素および栄養の供給を調節する。このセットアップでは、圧力調整拍動または一定流量のいずれかで、動的な文化が可能になります。
本研究では、成功しMPNSTsのための静的および動的な3次元培養システムの両方を確立することができる。より自然な3D環境内癌腫瘍をモデル化する機能を発見、テスト、および検証を可能にします人間のようなモデルでは、将来の医薬品。
新薬は、その品質、安全性、市場の承認の前に有効性に関して検証する必要があります。現在までに、動物実験は、薬物テストと検証のための標準的な方法である。しかし、種特異的な違いのために、動物実験では、多くの場合、総合的に、人間1の化合物の効果を評価しない。このため、新たな薬剤および物質のin vitro試験のために使用することができるヒト組織モデルを生成することが重要である。
私たちのグループの焦点の一つは、私たちの生物学的に血管新生足場(BioVaSc)2,3 を用いたin vitro試験モデルを作成することです。 BioVaScは、静的または動的3Dマトリックス系として使用することができる。静置培養のために、脱細胞化ブタ空腸のセグメント(小腸粘膜下組織SIS-MUC)は、細胞の再シードに金属インサートに配置されます。例えば、癌細胞および内皮細胞のような種々の細胞は、足場上で培養することができる。
<pダイナミックな文化のためのクラス= "jove_content">、BioVaScは血管系全体または足場の表面を横切って流れを適用するバイオリアクターシステムに取り付けられている。現在のバイオリアクターは、細胞4の分化や増殖に作用する、生物学的、機械的、または電気的刺激を実施する。組織工学の分野におけるバイオリアクターについては、基本的なコンセプトは、人体内の条件をシミュレートすることである。ここで、細胞は、それらが互いにおよびその周囲の細胞外マトリックスと相互作用することができる自然環境が提供される。 インビトロ試験系または移植片の製造のために、適切なキャリア構造およびバイオリアクターシステムを用いて細胞の自然環境を模倣する能力は重要で5である。そのため、より複雑で技術的に要求のデバイスは、これらのタスク6を満たすために開発されなければならない。それはestablすぐ足場を使用することも可能である原因栄養動脈、静脈、および接続毛細血管床を含む保存管状構造への血管化モデルのishment。すべてのブタ細胞は、化学的、機械的および酵素的脱細胞、および足場ガンマ線滅菌によって除去する必要がある。復元された管状の血管構造は、その後、例えば、pH、温度、圧力、栄養供給と廃棄物除去6と生体力学的および/ または生化学的パラメータを模倣する再循環灌流バイオリアクター7を用いて、ヒト微小血管内皮細胞で再播種することができる。管状構造の再内皮化は、コラーゲン性足場3,7内で、人間の血管と同等に作成されます。次のステップでは、前者の管腔(粘膜)の表面には、共培養3,7,8を確立するために、初代ヒト細胞を接種することができます。
本研究では、3D腫瘍テストシステムは、原発STと腫瘍細胞株を共培養することで設定されているSIS-MUC上の静的および動的条件下romal細胞。
腫瘍研究における2Dおよび3D培養系を比較すると、3Dシステムは、より高価なアプローチであるにもかかわらず、良好な生物学的微小環境における条件を模倣することが証明されている。これは、いくつかの腫瘍細胞は、腫瘍内の実際の状況に応じた一般的な2D培養12日よりも3D培養においてはるかに遅く成長することを示すことができた。ビッセルらは発癌性乳癌細胞の挙動をより正確にマトリックス内の3D培養が細胞-ECM相互作用を提供するとき、細胞形態およびシグナル伝達などのin vivoでの状況を反映していることを自分の仕事にあった。さらに、それらは、環境の相互作用の変化が正常な表現型に悪性細胞の復帰につながっていることを実証することによって、3Dで細胞外環境の重要性を強調した。さらに、最も重要なことは、これらの結果はまた、10,11 インビボ動物モデルにおいて確認することができた。
ontent "> in vivo動物実験およびインビトロでの組織モデルでの直接比較は、両方のシステムに利点と欠点を明らかにしている。in vitroモデルの一つの利点は、はるかに優れたリアルタイムまたは顕微鏡による固定撮像の許可である。制限があるそれらは、免疫応答をホスト、 インビボ系しばしば進行のに対し、血管系および小分子の正常な輸送の現在の不足を静的または短期的条件を模倣、及び他の細胞-細胞相互作用は、in vitroモデル12のさらなる欠点であるため、3Dを本研究で提示されvitro系で動物実験に有望な追加を提供しています。彼らは、人間の生物に良い比較を提供するため、実験的な誤解を最小限に抑える。バイオミメティックvivoモデル系では、それゆえ癌および転移性の広がりに依存するどのように勉強し、より関連性の高いとなりますtumorigを規制する微小環境条件にenesis 11。我々の研究は、SIS-MUCによって提供される3D環境は、共通の2D細胞培養では観察されない複数の腫瘍細胞の様組織の形成、( 図3Aを参照)をもたらすことを示している。また、腫瘍生検由来の初代細胞の使用は、個別化医療、患者の個々のニーズに応じて、最善の治療を特定することを目的と規律に向けた非常に重要なステップです。生検材料から単離された一次患者特有の腫瘍細胞を組み込むことは、治療戦略のインビトロ試験において可能にする。そのような試験システムにより、時間とコスト削減ハイスループットスクリーニングにおけるその異なる薬剤との組み合わせを調査することであろう。さらに、この研究で示されるように、腫瘍関連間質細胞の集積は、腫瘍の微小環境に影響を与える腫瘍進行13は 、パーソナライズされたアプローチのために重要であると証明するかもしれないようSUITABル·治療標的。
代替的にパーソナライズされたアプローチには、我々の腫瘍モデルを確立し、腫瘍形成性細胞株の取り込みによって一般化された腫瘍試験システムとして機能するように修飾することができる。これは、基本的な研究目的のための有望な適応したものです。薬物検査の両方のために血管構造の存在が治療物質の分布および取り込みをテストするために必要とされて近づく。 SIS-MUC行列がバリア取り込み研究のために、一次MVECと側底播種を可能にする、BioVaScの保存の血管構造の再シードはさらに、薬物送達の研究を改善します。
組織モデルを作成するために、3次元生分解性マトリックスは、異なる細胞型14の共培養のためのフレームワークとして使用することができる。このような3次元マトリックスの使用は、多くの場合、機能的血管新生が存在しないことによって制限される。この問題は、保存血管strを提供BioVaScの使用によって解決することができるuctures、その内皮細胞で再播種することができる。さらに、BioVaScは、細胞の接着性を確保し、組織の分化を促進する細胞外成分を提供する。また、バイオ人工3D組織7,8,15の長年の組織特異的機能を可能にします。機能的血管代替物のエンジニアリングのための前提条件は、人間の生理的および生体力学的条件の模倣である。従って、 インビトロでこれらの要件を実現することができるバイオリアクターシステムは、生物学的な腫瘍モデルを作成するための極端な関心がある。
BioVaScの組み合わせは、バイオリアクター技術および異なる細胞型の共培養は、例えば血管新生および転移などの癌の進行に関連するメカニズムの研究を可能にする血管新生した腫瘍組織を生成するための非常に有望な方法である。我々は同等を提供することで、動物実験を補完するための有望なアプローチとして、腫瘍モデルを見るヒト腫瘍生理機能。
The authors have nothing to disclose.
著者らは、バイオリアクターやバイオリアクター培養器を開発するために彼の技術的なサポートのために月ハンスマン(フラウンホーファーIGB、シュツットガルト)に感謝したいと思います。
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
Collagenase solution | SERVA | 17454 | (500 U/ml) |
Dispase solution | Gibco | 17105-041 | (2.0 U/ml) |
DMEM, high-glucose | PAA | G0001,3010 | |
DNase | ROCHE | 10104159001 | 200 mg solved in 500 ml PBS+ + 1% PenStrep |
DZ solution | Roth | 3484.2 | 34 g Sodium Desoxychelate, in 1 L Ultra-pure water |
FCS | LONZA | DE14-801F | |
IHC-Kit DCS SuperVision 2 HRP | DCS | PD000KIT | |
medical pressure transducer | MEMSCAP | SP844 | |
monoclonal mouse anti-human Von Willebrand Factor | DAKO Cytomation | M0616 | Clone F8/86 0.12 μg/ml |
mouse monoclonal anti-human p53 | DAKO Cytomation | IS616 | Clone DO-7 ready-to-use |
peristaltic pump | Ismatec | ||
sterile disposable dome | MEMSCAP | 844-28 | |
Trypsin / EDTA solution | PAA | L11-003 | 0,05% |
VascuLife (VEGF-Mv) | Lifeline | LL-0003 | |
Versene | Gibco | 15040-033 |