테스트 시스템으로 인간의 3D 종양 조직을 만들 수있는 방법이 설명되어 있습니다. 이러한 기술은 decellularized 생물 혈관을 비계 (BioVaSc), 인간의 기본 세포와 흐름 생물 반응기의 동적 조건에서뿐만 아니라 정적에서 배양 할 수있는 종양 세포 라인을 기반으로합니다.
암은 전 세계적으로 사망의 주요 원인 중 하나입니다. 현재 치료 전략은 주로 부적절하게 생체 내에서 생리적 조건을 반영하는 차원 배양 시스템에서 개발된다. 생물학적 차원 매트릭스 조직의 조직 및 세포 분화 연구를 허용 세포에게 세포가 자기 조직화 할 수있는 환경을 제공한다. 이러한 발판이 직접 3D 세포 세포 상호 작용을 연구하는 여러 종류의 세포 혼합물을 시드 할 수 있습니다. 암 종양의 3D 복잡성을 모방하기 위해, 우리의 그룹은 3 차원 생체 외 종양의 테스트 시스템을 개발했다.
우리의 3D 조직의 테스트 시스템 모델 우리가 우리의 decellularized 돼지 jejunal 세그먼트 유래 생물 혈관 지지체 (BioVaSc) 설립 악성 말초 신경 칼집 종양 (MPNSTs)의 생체 내 상황. 우리의 모델에서, 우리는 주요 섬유 아 세포, 미세 혈관 내피 세포 (와 수정 BioVaSc 행렬을 다시 시드mvECs) 및 S462 종양 세포주. 정적 배양 들어 BioVaSc의 혈관 구조를 제거하고 남아있는 지지체는 일측 (소장 점막하 SIS-MUC)에 열린 절단된다. 그 결과 행렬은 두 개의 금속 링 (세포 크라운) 사이에 고정되어 있습니다.
또 다른 옵션은 배양 응력 전단 세포를 노출 유동 바이오 리액터에서 세포 시딩 SIS-MUC이다. 여기서, 바이오 리액터는 자체 구성 인큐베이터에서 연동 펌프에 연결된다. 컴퓨터는 혈압, 온도, 유량 등의 파라미터를 통해 동맥혈 산소 및 영양소의 공급을 조절한다. 이 설정은 압력 조절 박동 또는 일정한 흐름 중 하나와 역동적 인 문화를 할 수 있습니다.
이 연구에서, 우리는 성공적으로 MPNSTs에 대한 정적 및 동적 3 차원 배양 시스템을 모두 구축 할 수 있습니다. 보다 자연스러운 3 차원 환경에서 암 종양을 모델링하는 능력은 발견, 테스트 및 검증을 가능하게인간과 같은 모델에서 미래 제약.
새로운 의약품의 품질, 안전성, 시장의 승인 이전에 효능에 관해서는 검증해야합니다. 지금까지 동물 실험은 약물 테스트 및 검증을위한 표준 방법입니다. 그러나, 종 특이 차이로 동물 실험은 종종 종합적 인간 하나의 화합물의 효과를 평가하지 않는다. 이 때문에, 새로운 약물 및 물질의 시험 관내 시험에 사용될 수 인체 조직의 모델을 생성하는 것이 중요하다.
우리 그룹의 초점을 맞추고 중 하나는 생물학적 혈관 지지체 (BioVaSc) 2,3 생체 외 시험 모델을 만드는 것입니다. BioVaSc는 정적 또는 동적 3D 매트릭스 방식으로 사용될 수있다. 정적 문화, decellularized 돼지 jejunal 세그먼트 (소장 점막하 SIS-MUC)는 셀 다시 시드를위한 금속 삽입물에 배치됩니다. 암과 내피 세포 등 다양한 세포는 발판에 배양 할 수있다.
<p역동적 인 문화에 대한 클래스 = "jove_content">, BioVaSc은 혈관을 통해 또는 지지체의 표면에 걸쳐 흐름을 적용하는 생물 반응기 시스템에 연결되어 있습니다. 현재 바이오 리액터는 세포 4의 분화 나 증식에 작용, 생물학적, 기계적 또는 전기적 자극을 구현합니다. 조직 공학 분야에서 생물 반응기의 경우, 기본 개념은 인체의 조건을 시뮬레이션하는 것이다. 상기 세포는 서로 그들의 주변 세포 외 기질 (extracellular matrix)과 상호 작용할 수있는 자연 환경을 제공한다. 시험 관내 시험 시스템 또는 이식의 생산을위한 적당한 담체 구조 및 바이오 리액터 시스템과 함께 세포의 자연 환경을 모방하는 능력이 중요하다 5. 따라서, 더 복잡하고 기술적으로 장치는 이러한 작업 6을 충족하기 위해 개발해야합니다.그것은 establ입니다 우리의 발판을 사용하는 것이 또한 가능하다때문에 먹이 동맥, 정맥, 그리고 연결 모세관 침대를 포함하는 보존 관 구조에 혈관 모델의 징벌. 모든 돼지 세포는 화학 기계적 및 탈세 포화 효소에 의해 제거 할 필요가 있고, 발판 감마 멸균. 복원 된 관상 혈관 구조는 이후 같은 산도, 온도, 압력, 영양 공급 및 폐기물 제거 6과 생체 역학 및 / 또는 생화학 매개 변수를 모방 한 재순환 관류 생물 반응기 7을 사용하여 인간의 미세 혈관 내피 세포로 다시 시드 할 수 있습니다. 관 구조의 재 내피 세포는 콜라겐 발판 3,7 내에서 인간의 혈관 상당을 만듭니다. 다음 단계에서, 이전의 루멘 (점막)의 표면은 공동 배양 3,7,8을 확립 일차 인간 세포로 접종 될 수있다.
본 연구에서는 3 차원 종양 테스트 시스템은 일차 명세서와 종양 세포주를 공동 배양하여 설정된SIS-MUC에 대한 정적 및 동적 조건에서 romal 세포.
더 비싼 접근 방식에도 불구하고 종양 연구, 3D 시스템, 2 차원 및 3 차원 배양 시스템을 비교했을 때, 더 나은 생물 미세 환경의 조건을 모방 입증했다. 그것은 몇 가지 종양 세포가 실제 종양의 상황에 따라되는 일반 2D 문화 (12)에 비해 3D 문화에 훨씬 느리게 성장하는 것으로 나타 수 있습니다. 비셀과 동료 발암 유방 세포의 동작은 매트릭스 내에서 3D 문화 휴대 ECM 상호 작용을 제공하고 더 정확하게 세포 형태 및 신호를 포함하는 생체 내 상황을 반영하는 것이 자신의 작품에서 보여 주었다. 또한, 이들은 환경 상호 작용의 변화가 정상적인 표현형으로 악성 세포의 복귀 주도 것을 입증함으로써 3D로 세포 외 환경의 중요성을 강조 하였다. 또한 가장 중요한 것은, 이러한 결과는 생체 내 동물 모델 (10, 11)에있는 확인할 수 있었다.
ontent "> 생체 내 동물 실험과 생체 조직 모델의 직접 비교는 두 시스템의 장점과 단점을 알 수있다. 체외 모델의 장점 중 하나는 더 나은 실시간 또는 현미경으로 고정 된 이미지의 권한입니다. 제한입니다 그들은 생체 시스템은 종종 진행하는 반면, 정적 또는 단기 조건을 모방. 혈관과 작은 분자의 정상적인 전송의 현재 부족. 면역 반응을 호스트 및 기타 세포 – 세포 상호 작용이 생체 외 모델 12의 추가 단점이 있습니다 따라서, 3D 생체 시스템에서 본 연구에서 제시된는 동물 실험에 유망한 추가를 제공합니다. 그들은 인간 유기체에 더 나은 비교를 제공하고, 따라서 실험 오해를 최소화 할 수 있습니다. 생체 모방 생체 모델 시스템에 따라서 암 및 전이성 확산 의존하는 방법을 연구하는 것이 더 관련이 될 것입니다 tumorig을 조절 미세 환경 조건에enesis 11.우리의 연구는 SIS-MUC에서 제공하는 3D 환경은 일반적인 2 차원 세포 배양에서 관찰되지 않은 세포보다 종양과 같은 조직 형성, (그림 3A 참조)에 이르게 것을 보여줍니다. 또한, 종양 생검에서 파생 된 일차 전지의 사용은 맞춤 의학, 환자의 개인의 필요에 따라 최선의 치료를 식별하는 것을 목표로 훈련을 향한 매우 중요한 단계입니다. 생검 재료에서 분리 기본 환자 특정 종양 세포를 통합하면 치료 전략의 시험 관내 시험에 수 있습니다. 이러한 테스트 시스템은 가능한 시간 및 비용 절감 높은 처리량 검사에 그 다른 약물과 조합을 조사 할 것입니다. 종양의 미세 환경의 영향 종양의 진행 (13)이 suitab으로 증명할 수 있으므로 또한, 본 연구에서와 같이 종양 관련 기질 세포의 통합은 개인의 접근 방식에 중요하다르 치료 대상.
대안 적 개인화 방식으로, 우리의 종양 모델 확립 종양 형성 세포 라인의 혼입에 의해 일반화 된 종양 테스트 시스템의 역할을하도록 변경 될 수있다. 이 기본 연구 목적을위한 유망한 적응이다. 양쪽 약물 테스트에 대한 혈관 구조의 존재는 치료 물질의 분포 및 흡수를 테스트하는 데 필요한 접근한다. SIS-MUC 행렬 장벽 흡수 연구를위한 기본 mvEC와 기저 시드를 허용 BioVaSc의 보존 혈관 구조의 다시 시드가 더 약물 전달 연구를 향상시킬 것입니다.
조직의 모델을 생성하기 위해, 3D 생분해 성 매트릭스는 서로 다른 세포 유형 (14)의 공 배양을위한 프레임 워크로서 사용될 수있다. 이러한 3D 행렬의 사용은 종종 혈관 기능의 부재에 의해 제한된다. 이 문제는 보존 혈관 STR을 구비 BioVaSc의 사용에 의해 해결 될 수있다uctures, 이는 내피 세포로 다시 시드 할 수 있습니다. 게다가 BioVaSc는 세포의 부착을 보장하고 조직의 분화를 촉진 세포 외 성분을 제공한다. 또한 bioartificial 3D 조직 7,8,15의 장시간의 조직 특이 기능을 가능하게한다. 기능 혈관 대체의 설계를위한 전제 조건은 인간의 생리적, 생 역학적 조건의 모방이다. 따라서, 시험 관내에서 이러한 요구 사항을 구현할 수 바이오 리액터 시스템은 생물학적 종양 모델을 생성하기위한 극단적 인 관심이다.
BioVaSc의 조합은, 생물 반응기 기술 및 다른 세포 유형의 공동 배양은 혈관 신생 및 전이와 같은 암 진행에 대한 중요한 메커니즘의 연구를 허용 혈관 종양 조직을 생성하기 위해 매우 유망한 방법이다. 우리는 동등한를 제공하여 동물 연구를 보완하기위한 유망한 방법으로 종양 모델을 참조하십시오인간의 종양 생리학.
The authors have nothing to disclose.
저자는 생물 반응기와 생물 반응기 인큐베이터를 개발하기 위해 자신의 기술 지원을 위해 월 Hansmann (프라운호퍼 IGB, 슈투트가르트) 감사의 말씀을 전합니다.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
Collagenase solution | SERVA | 17454 | (500 U/ml) |
Dispase solution | Gibco | 17105-041 | (2.0 U/ml) |
DMEM, high-glucose | PAA | G0001,3010 | |
DNase | ROCHE | 10104159001 | 200 mg solved in 500 ml PBS+ + 1% PenStrep |
DZ solution | Roth | 3484.2 | 34 g Sodium Desoxychelate, in 1 L Ultra-pure water |
FCS | LONZA | DE14-801F | |
IHC-Kit DCS SuperVision 2 HRP | DCS | PD000KIT | |
medical pressure transducer | MEMSCAP | SP844 | |
monoclonal mouse anti-human Von Willebrand Factor | DAKO Cytomation | M0616 | Clone F8/86 0.12 μg/ml |
mouse monoclonal anti-human p53 | DAKO Cytomation | IS616 | Clone DO-7 ready-to-use |
peristaltic pump | Ismatec | ||
sterile disposable dome | MEMSCAP | 844-28 | |
Trypsin / EDTA solution | PAA | L11-003 | 0,05% |
VascuLife (VEGF-Mv) | Lifeline | LL-0003 | |
Versene | Gibco | 15040-033 |