Métodos para criar tecidos tumorais 3D humanos como sistemas de teste são descritos. Estas tecnologias são baseadas num descelularizado Biológica vascularizada andaime (BioVaSc), células humanas primárias e uma linha de células tumorais, que podem ser cultivadas em condições estáticas, bem como sob condições dinâmicas de um bio-reactor de fluxo.
O câncer é uma das principais causas de morte em todo o mundo. Estratégias terapêuticos actuais são predominantemente desenvolvida em sistemas de cultura em 2D, que reflectem adequadamente as condições fisiológicas in vivo. Matrizes 3D biológicos fornecer células de um ambiente no qual as células podem auto-organizar-se, permitindo que o estudo da organização do tecido e da diferenciação celular. Tais andaimes podem ser semeado com uma mistura de diferentes tipos de células para estudo de interações célula-célula 3D diretos. Para imitar a complexidade 3D de tumores cancerosos, o nosso grupo desenvolveu um sistema de teste in vitro tumor 3D.
Nossos modelos 3D sistema de teste do tecido a situação in vivo de tumores malignos da bainha dos nervos periféricos (MPNSTs), que estabeleceu com a nossa descelulada segmento jejunal porcino andaime vascularizado biológico (BioVaSc). No nosso modelo, reseeded uma matriz BioVaSc modificado com fibroblastos primários, células endoteliais microvasculares (mvECs) e a linha de células de tumor S462. Para a cultura estática, a estrutura vascular do BioVaSc é removido e o andaime remanescente é cortada de um lado aberto (Submucosa do Intestino Delgado SIS-MUC). A matriz resultante é então fixado entre dois anéis metálicos (coroas de células).
Outra opção é a cultura da célula-semeado SIS-Muc num sistema de bioreactor de fluxo que expõe as células ao cisalhamento. Aqui, o bioreactor está ligada a uma bomba peristáltica num incubador de auto-construída. Um computador regula o oxigênio e nutrientes através de parâmetros como a pressão arterial, temperatura e vazão. Esta configuração permite uma cultura dinâmica, com ou pulsátil regulado por pressão ou fluxo constante.
Neste estudo, foi possível estabelecer com sucesso tanto um sistema de cultura 3D estática e dinâmica para MPNSTs. A capacidade de modelar os tumores de câncer em um ambiente 3D mais natural permitirá a descoberta, teste e validação defuturos fármacos em um modelo semelhante à humana.
Novos produtos farmacêuticos devem ser validados em relação à sua qualidade, segurança e eficácia antes da autorização de mercado. Até o momento, experimentos com animais são o método padrão para o teste e validação de drogas. No entanto, devido às diferenças específicas de espécies, as experiências com animais, muitas vezes não avaliar exaustivamente o efeito dos compostos em humanos 1. Por esta razão, é importante para gerar modelos de tecidos humanos que podem ser utilizados para testes in vitro de novos medicamentos e substâncias.
Um dos focos do nosso grupo é a criação de modelos em teste in vitro com o nosso andaime vascularizado biológico (BioVaSc) 2,3. O BioVaSc pode ser usado como um sistema de matriz em 3D estático ou dinâmico. Para a cultura estática, o segmento jejunal suína descelulada (Small Intestinal Submucosa SIS-MUC) é colocado em uma pastilha de metal para reseeding celular. Várias células, tais como o câncer e as células endoteliais podem ser cultivadas no cadafalso.
<pclasse = "jove_content"> Para a cultura dinâmica, o BioVaSc está ligado a um sistema de bioreactor de fluxo que se aplica em toda a vasculatura ou em toda a superfície do andaime. Biorreatores atuais implementar estímulos biológicos, mecânicos ou elétricos que agem sobre a diferenciação ou proliferação de células 4. Para biorreatores no campo da engenharia de tecidos, o conceito básico é o de simular as condições do corpo humano. Em que, as células são fornecidos um ambiente natural em que eles possam interagir uns com os outros e a sua matriz extracelular circundante. Para a produção de sistemas de teste in vitro ou de transplantes, a capacidade de imitar o ambiente natural das células com uma estrutura de suporte adequada e um sistema de bioreactor é crítico 5. Portanto, os dispositivos mais complexos e tecnicamente exigentes devem ser desenvolvidas a fim de cumprir essas tarefas 6.Além disso, é possível usar o nosso andaime para o establishment de um modelo vascularizado devido às estruturas tubulares conservados, os quais incluem a alimentação da artéria, veia, e o leito capilar de ligação. Todas as células de suíno têm de ser removidos por descelularização química, mecânica e enzimática, e o andaime esterilizado-gama. As estruturas vasculares tubulares restaurado pode ser subsequentemente re-semeadas com células endoteliais microvasculares humanas, utilizando um bioreactor de perfusão de recirculação 7, que imita os parâmetros biomecânicos e / ou bioquímicos, tais como pH, temperatura, pressão, o fornecimento de nutrientes e de remoção de desperdícios 6. A re-endotelização de estruturas tubulares cria um vaso sanguíneo equivalente humano no andaime 3,7 colagenosa. No passo seguinte, a superfície dos antigos lúmen (mucosa) podem ser semeadas com células humanas primárias para estabelecer co-culturas 3,7,8.
Neste estudo um sistema de teste tumor 3D é criado pelo co-cultura de uma linha de células tumorais com rua principalcélulas romal em condições estáticas e dinâmicas sobre o SIS-Muc.
Ao comparar os sistemas de cultura em 2D e 3D em pesquisa do tumor, sistemas 3D, apesar de ser a abordagem mais caro, provaram para imitar as condições em microambientes biológicos melhor. Pode ser mostrado que algumas células de tumor crescer muito mais lenta em cultura em 3D de uma cultura em 2D comum 12, o qual está em conformidade com a situação em tumores reais. Bissell e colaboradores mostraram no seu trabalho que o comportamento de células cancerígenas da mama reflecte a situação in vivo, incluindo a morfologia celular e de sinalização, de forma mais precisa, quando uma cultura 3D dentro de uma matriz oferece as interacções célula-ECM. Além disso, eles enfatizaram a importância do meio extracelular em 3D, demonstrando que as mudanças nas interações ambientais levou à reversão das células malignas a um fenótipo normal. Além disso e mais importante ainda, estes resultados podem também ser confirmada em modelos animais in vivo 10,11.
ONTEÚDO "> A comparação direta de experimentos in vivo em animais e em modelos in vitro de tecido revela vantagens e desvantagens em ambos os sistemas. Uma das vantagens de modelos in vitro é a permissão de um real-time muito melhor ou imagem fixa por microscopia. Uma limitação é que eles imitam condições estáticas ou de curto prazo, ao passo que sistemas in vivo, muitas vezes o progresso. A atual falta de vascularização e transporte normal de pequenas moléculas, resposta imune do hospedeiro, e outras interações célula-célula são outras desvantagens de modelos in vitro 12. Portanto, 3D em sistemas in vitro, tal como apresentado neste estudo oferecem um complemento promissor para experimentos com animais. Eles fornecem uma melhor comparabilidade com o organismo humano e, portanto, minimizar erros de interpretação experimentais. Biomiméticos em sistemas modelo vivo será, portanto, tornam-se mais relevantes para estudar como o câncer e metástase é dependente em condições micro-ambientais que regulam tumorigenesis 11.O nosso estudo mostra que o ambiente 3D fornecida pelo SIS-Muc conduz a uma formação mais tumoral tecido de células, a qual não é observada na cultura de células em 2D comum (ver Figura 3A). Além disso, o uso de células primárias derivadas de biópsias de tumores é um passo muito importante para a medicina personalizada, uma disciplina que tem por objetivo identificar o melhor tratamento, dependendo das necessidades individuais do paciente. A incorporação de células primárias de tumor específicos do paciente, isolado a partir de material de biopsia permitirá em testes in vitro de estratégias terapêuticas. Tais sistemas de teste, será possível investigar diferentes drogas e suas combinações, com um tempo de e rastreio de alto rendimento de poupança de custos. Além disso, a integração das células do estroma associado a tumores, como mostrado neste estudo, é importante para a abordagem personalizada, uma vez que a progressão influências do microambiente do tumor um tumor de 13 e pode revelar-se como suitabalvo terapêutico le.
Como alternativa a uma abordagem personalizada, o nosso modelo de tumor pode ser modificado para servir como um sistema de teste do tumor generalizada pela incorporação de linhas de células tumorais estabelecidos. Esta é uma adaptação promissor para fins de pesquisa básica. Para ambos os testes de drogas aproxima da presença de uma estrutura vascular necessária para testar a distribuição e absorção de substâncias terapêuticas. A matriz SIS-Muc permite a semeadura basolateral com MVEC primário para estudos de captação de barreira, o repovoamento das estruturas vasculares preservadas da BioVaSc irá melhorar ainda mais o estudo de entrega de drogas.
A fim de criar modelos de tecidos, uma matriz biodegradável 3D pode ser utilizado como uma estrutura para a co-cultura de diferentes tipos de células 14. O uso de tais matrizes 3D é frequentemente limitada pela falta de uma vascularização funcional. Este problema pode ser resolvido pela utilização do BioVaSc, que oferece preservada str vaso sanguíneouctures, o qual pode ser re-semeadas com células endoteliais. Além disso, o BioVaSc fornece componentes extracelulares, que garantem a aderência das células e facilitar a diferenciação de tecidos. Ele também permite que a função específica do tecido de longa data de bioartificial tecidos 3D 7,8,15. O pré-requisito para a engenharia dos substitutos vasculares funcionais é a imitação de fisiológica humana e condições biomecânicas. Portanto, sistemas de biorreatores, que pode implementar estes requisitos in vitro, são de extremo interesse para a criação de modelos de tumores biológicos.
A combinação do BioVaSc, a tecnologia de bio-reactor e co-cultura de diferentes tipos de células é um método muito promissor para gerar tecidos de tumor vascularizado, o que permitirá o estudo de mecanismos relevantes para a progressão do cancro, tais como angiogénese e metástase. Vemos tais modelos de tumor como uma abordagem promissora para complementando os estudos animais, fornecendo um equivalentepara a fisiologia do tumor humano.
The authors have nothing to disclose.
Os autores gostariam de agradecer a Jan Hansmann (Fraunhofer IGB, Stuttgart) por seu apoio técnico para desenvolver biorreatores e incubadora biorreator.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
Collagenase solution | SERVA | 17454 | (500 U/ml) |
Dispase solution | Gibco | 17105-041 | (2.0 U/ml) |
DMEM, high-glucose | PAA | G0001,3010 | |
DNase | ROCHE | 10104159001 | 200 mg solved in 500 ml PBS+ + 1% PenStrep |
DZ solution | Roth | 3484.2 | 34 g Sodium Desoxychelate, in 1 L Ultra-pure water |
FCS | LONZA | DE14-801F | |
IHC-Kit DCS SuperVision 2 HRP | DCS | PD000KIT | |
medical pressure transducer | MEMSCAP | SP844 | |
monoclonal mouse anti-human Von Willebrand Factor | DAKO Cytomation | M0616 | Clone F8/86 0.12 μg/ml |
mouse monoclonal anti-human p53 | DAKO Cytomation | IS616 | Clone DO-7 ready-to-use |
peristaltic pump | Ismatec | ||
sterile disposable dome | MEMSCAP | 844-28 | |
Trypsin / EDTA solution | PAA | L11-003 | 0,05% |
VascuLife (VEGF-Mv) | Lifeline | LL-0003 | |
Versene | Gibco | 15040-033 |