En ny metode, der kombinerer intraokulær transplantation og konfokal mikroskopi muliggør langsgående, non-invasiv real-time scanning med encellede løsning inden podede væv<em> In vivo</em>. Vi viser, hvordan transplantere pancreasøer i forkammeret af muse øjet.
Intravital billedbehandling har vist sig som et uundværligt værktøj i biologisk forskning. Ved fremgangsmåden har mange billeddannelsesteknikker blevet udviklet til at studere forskellige biologiske processer hos dyr ikke-invasivt. Men en stor teknisk begrænsning i eksisterende intravital billeddiagnostiske metoder er den manglende evne til at kombinere non-invasiv, langsgående billeddannelse med encellede opløsning kapaciteter. Vi viser her, hvordan transplantation ind i det forreste kammer i øjet omgår så væsentlig begrænsning giver en alsidig eksperimentel platform, der muliggør ikke-invasiv, langsgående billeddannelse med cellulær opløsning in vivo. Vi demonstrerer transplantation procedure i mus og giver repræsentative resultater ved anvendelse af en model med klinisk relevans, nemlig pancreasø transplantation. Ud over at muliggøre direkte visualisering i en række væv transplanteret ind i det forreste kammer i øjet, giver denne fremgangsmåde en platform til urenn lægemidler ved at udføre langsigtet opfølgning og kontrol i målvæv. Grund af dens alsidighed, vævs / celle transplantation ind i forkammeret i øjet ikke blot fordele transplantation terapier, udvider den til andre in vivo anvendelser for at studere fysiologiske og patofysiologiske processer, såsom signaltransduktion og cancer eller autoimmune sygdomme udvikling.
Fremskridt i intravital mikroskopi har afsløret fysiologiske fænomener ikke forudsagt af in vitro-undersøgelser 1. Dette understreger udfordringen i at oversætte resultater opnået ved konventionel in vitro-metoder i den levende dyr. I det seneste årti var visualisering af væv i levende dyr væsentligt forbedret af de teknologiske fremskridt i billeddiagnostiske metoder 2, 3, 4, 5, 6. Dette har givet anledning et behov for in vivo imaging tilgange med mulig anvendelse i eksperimentelle dyremodeller for at muliggøre langsgående visualisering af målvæv ikke-invasivt.
Billeddannelsesteknikker, såsom magnetisk resonans og positronemissionstomografi eller bioluminescens har muliggjort ikke-invasiv billeddannelse af organer / væv dybt inde i legemet 7-8, 9. Men disse teknikker kan ikke opnå enkelt celle opløsning som følge af høje baggrundssignaler og lav rumlig opløsning, på trods af anvendelsen of høj kontrast materialer eller vævsspecifik luminescens 4. Dette blev behandlet med fremkomsten af to-foton fluorescens konfokal mikroskopi 10. To-foton mikroskopi aktiveret intravital billeddiagnostiske undersøgelser for at visualisere og kvantificere cellulære begivenheder med hidtil usete detaljer 11, 12. Dette har ført til karakteriseringen af de vigtigste biologiske processer i sundhed og sygdom 13, 14, 15, 16. Mens banebrydende intravital billeddiagnostiske undersøgelser primært har "efterlignet" in vivo forhold i udskårne væv (f.eks lymfeknuder), har andre undersøgelser brugt invasive metoder til billede udsatte målvæv in situ 17, 18, 19, 20, 21. Andre undersøgelser har også brugt "window kammer modeller" at omgå begrænsninger i forbindelse med invasive metoder og begrænset imaging opløsning in vivo 22, 23, 24, 25. I vinduet kammeret model, er et kammer med et transparent vindue kirurgisk implanteret ind i huden i forskelleje steder (ryg eller ørehud, bryst-fedtpuden, lever, osv.) af dyret (fx mus, rotte, kanin). Selv om denne fremgangsmåde tydeligt giver høj opløsning in vivo billeddannelse, kræver det en invasiv kirurgi at implantere afdeling og kan ikke være i stand til at rumme langsgående billeddiagnostiske undersøgelser over flere uger eller måneder 22.
Det blev for nylig vist, at en kombination af høj opløsning konfokal mikroskopi med en minimalt invasiv procedure, nemlig transplantation ind i det forreste kammer i øjet (ACE) tilvejebringer en "naturlig organ vindue" som en kraftfuld og alsidig in vivo-billeddannelse platform 26, 27. Transplantation ind i ACE er blevet anvendt i de sidste årtier til at studere biologiske aspekter af en række væv 28, 29, 30, og den seneste kombination med høj opløsning billeddannelse aktiveret undersøge fysiologien af pancreasøer med enkeltcelle-opløsning ikke- invasivt og i længderetningen <sup> 26, 27. Denne fremgangsmåde blev anvendt til at studere autoimmune responser under udviklingen af type 1 diabetes i dyremodeller (upublicerede data). Det blev også anvendt til at undersøge pancreasudviklingen, såvel som, i studier af nyrefunktionen ved at transplantere ind i ACE pancreas knopper eller individuelle nyrernes glomeruli, henholdsvis (upublicerede data). En nylig rapport ved hjælp af denne tilgang yderligere demonstreret sin ansøgning om at studere immunresponser efter pancreasø transplantation 31. Vigtigere er det, denne undersøgelse viste, at transplantation ind i det forreste kammer i øjet tilvejebringer en naturlig organ vindue til at udføre: (1) langsgående, ikke-invasiv billeddannelse af transplanterede væv de vivo, (2) in vivo cytolabeling at vurdere cellulær fænotype og levedygtigheden i situ, (3) realtidssporing af infiltrerende immunceller i målvævet, og (4) lokal indgriben ved topisk påføring eller intraokulær injektion.
Her vi demonstrate hvordan man udfører transplantation ind i det forreste kammer i øjet med Langerhanske øer.
Murine pancreasøer blev isoleret ved hjælp af collagenasefordøjelse efterfulgt af oprensning på densitetsgradienter som beskrevet tidligere 33. Isolerede øer blev dyrket natten over før transplantation. Selv om dette ikke kræves, anbefales det at lade øerne at komme sig efter isoleringsproceduren. Dette er kritisk, når transplantation udføres i diabetiske recipienter, da det vil sikre transplantation for at overleve / robuste øer.
Transplantation er udført under genera…
The authors have nothing to disclose.
Vi anerkender Drs. Camillo Ricordi, Antonello Pileggi, R. Damaris Molano, Stephan Speier og Daniel Nyqvist for frugtbare diskussioner. Vi takker også Eleut Hernandez og Diego Espinosa-Heidmann til teknisk bistand, og Mike Valdes og Margaret Formoso for at få hjælp med videooptagelse. Byron Maldonado optaget, redigeret og produceret den endelige video. Forskningsstøtte blev leveret af Diabetes Research Institute Foundation ( www.DiabetesResearch.org ), NIH / NIDDK / NIAID (F32DK083226 til MHA; NIH RO3DK075487 til AC; U01DK089538 til PO.B.). Yderligere forskning støtte til PO.B blev tilvejebragt gennem midler fra Karolinska Institutet, det svenske forskningsråd, det svenske Diabetes Foundation, Family Erling-Persson Foundation, Familie Knut og Alice Wallenberg Foundation, Skandia Insurance Company Ltd, levende ( FP7-228.933-2), strategisk forskningsprogram i Diabetes på Karolinska Institutet, Novo Nordisk Fonden, og Berth von Kantzow Fond.
Name of reagent | Company | Catalogue number | Description/Comments |
IsoTHESIA (Isoflurane) | Buttler Animal Health Supply | 11695-6775-2 | 99.9% Isoflurane/ml |
Ketaset (Ketamine HCL) | Fort dodge Animal Health | 0856-2013-01 | Alternative injectable anesthesia |
Beprenex (Buprenorphine HCL) | Reckitt Benckiser Health Care (UK) Ltd. | 12496-075-7-1 | 0.3 mg/ml |
Erythromycin Ophthalmic Ointment USP, 0.5% | Akron | 17478-070-35 | Applied prophylactically to transplanted eye |
0.9% Sodium Chloride (Saline) | Hospira Inc. | 0409-7983-03 | For iv injection. Sterile |
PBS | Gibco | 10010-023 | 1X. Sterile |
CMRL medium 1066 | Cellgro | 98-304-CV | Supplemented, CIT modification. Preferred media for islets |