Transplantation in die Vorderkammer des Auges für Längs-, Non-invasive<em> In vivo</em> Imaging mit Single-cell Auflösung in Echtzeit
Summary
Ein neuer Ansatz, der intraokularen Transplantation und konfokale Mikroskopie ermöglicht Längs-, non-invasive Bildgebung in Echtzeit mit Single-Cell Auflösung innerhalb gepfropft Geweben<em> In vivo</em>. Wir zeigen, wie Langerhans-Inseln in die vordere Kammer der Maus Auge zu transplantieren.
Abstract
Intravital Imaging hat ein unverzichtbares Werkzeug in der biologischen Forschung entstanden. Bei dem Verfahren wurden viele bildgebende Verfahren entwickelt worden, um verschiedene biologische Prozesse bei Tieren nicht-invasiv zu studieren. Allerdings ist eine große technische Einschränkung in bestehende intravital bildgebenden Verfahren die Unfähigkeit, nicht-invasive, Längs-Bildgebung mit Single-Cell Auflösungsvermögen kombinieren. Wir zeigen hier, wie die Transplantation in der Vorderkammer des Auges, erhebliche Einschränkung bietet eine vielseitige experimentelle Plattform, die nicht-invasive, Längs-Bildgebung mit zellulärer Auflösung in vivo ermöglicht umgeht. Wir zeigen die Transplantation Verfahren in der Maus und bieten repräsentative Ergebnisse mit Hilfe eines Modells mit klinischer Relevanz, nämlich Inselzellen der Bauchspeicheldrüse Transplantation. Zusätzlich zur Aktivierung direkten Visualisierung in einer Vielzahl von Geweben in die vordere Kammer des Auges transplantiert, bietet dieser Ansatz eine Plattform, um Gerölln Medikamenten indem Langzeit-Follow up und Überwachung im Zielgewebe. Wegen ihrer Vielseitigkeit, Gewebe / Zell-Transplantation in die vordere Kammer des Auges nicht nur Vorteile Transplantationstherapien, erstreckt sie auf andere in vivo-Anwendungen der physiologischen und pathophysiologischen Prozessen wie Signaltransduktion und Krebs oder Autoimmunerkrankung Entwicklung zu studieren.
Introduction
Advances in Intravitalmikroskopie haben physiologischen Erscheinungen nicht vorhergesagt durch in vitro Studien 1 offenbart. Dies unterstreicht die Herausforderung bei der Umsetzung Erkenntnisse durch konventionelle In-vitro-Methoden erhalten in den lebenden Tier. In den letzten zehn Jahren wurde das Sichtbarmachen von Geweben in lebenden Tieren erheblich durch technologische Fortschritte in bildgebenden Verfahren 2, 3, 4, 5, 6 verbessert. Dies hat einen Bedarf für in vivo Bildgebung Ansätze mit mögliches Einsatzgebiet in experimentellen Tiermodellen zu longitudinalen Visualisierung von Zielgeweben nichtinvasiv ermöglichen vorangetrieben.
Bildgebende Verfahren wie Kernspintomographie und Positronen-Emissions-Tomographie oder Biolumineszenz haben nicht-invasive Bildgebung von Organen / Geweben tief innerhalb des Körpers 7-8, 9 aktiviert. Aber diese Techniken nicht erreichen können einzelne Zelle Auflösung aufgrund hoher Hintergrundsignale und niedriger räumlicher Auflösung, trotz der Verwendung of Hochkontrastmaterialien oder gewebespezifische Lumineszenz 4. Dies wurde mit dem Aufkommen der Zwei-Photonen-Fluoreszenz-Konfokalmikroskopie 10 gerichtet. Zwei-Photonen-Mikroskopie aktiviert intravital Bildgebung zur Visualisierung und Quantifizierung von zellulären Ereignissen mit beispielloser Details 11, 12. Dies hat zur Charakterisierung von wichtigen biologischen Prozessen in Gesundheit und Krankheit 13, 14, 15, 16 geführt. Während bahnbrechenden intravital bildgebenden Untersuchungen in erster Linie "nachgeahmt" in-vivo-Bedingungen in herausgeschnittene Gewebe (zB Lymphknoten), haben andere Studien invasive Ansätze zur Bild belichtet Zielgewebe verwendet in situ 17, 18, 19, 20, 21. Andere Studien haben auch "Fenster Kammer Modelle" Einschränkungen bei invasiven Konzepten und begrenzte Bildauflösung in vivo 22, 23, 24, 25 zugeordnet zu umgehen verwendet. In dem Fenster Kammer Modell wird eine Kammer mit einem transparenten Fenster chirurgisch in die Haut an verschie implantiertMiete Standorten (dorsal oder Ohr haut, Brustfettpolster, Leber, etc.) auf das Tier (zB Maus, Ratte, Kaninchen). Während dieser Ansatz ermöglicht eindeutig hochauflösenden in vivo Bildgebung erfordert es eine invasive Chirurgie, um die Kammer zu implantieren und ist möglicherweise nicht in der Lage, longitudinalen Bildgebungsstudien über mehrere Wochen oder Monate 22 unterzubringen.
Es wurde kürzlich gezeigt, dass die Kombination von hoher Auflösung konfokale Mikroskopie mit einem minimal-invasiven Eingriff, nämlich Transplantation in die vordere Kammer des Auges (ACE) eine "natürliche Körper Fenster" als eine leistungsfähige und vielseitige in vivo Bildgebung Plattform 26, 27. Transplantation in das ACE hat sich in den letzten Jahrzehnten eingesetzt, um biologische Aspekte einer Vielzahl von Geweben 28, 29, 30 zu studieren, und seine jüngsten Kombination mit hochauflösenden bildgebenden aktiviert das Studium der Physiologie der Langerhans-Inseln mit Einzel-Zell-Auflösung nicht invasiv und längs <sup> 26, 27. Dieser Ansatz wurde verwendet, um Autoimmunreaktionen bei der Entwicklung von Typ 1 Diabetes im Tiermodell (unveröffentlichte Daten) zu studieren. Es wurde auch verwendet, um Bauchspeicheldrüsenkrebs Entwicklung zu studieren, sowie in Studien der Nierenfunktion durch Transplantation in die ACE Pankreas Knospen oder einzelne Nierenglomeruli bzw. (unveröffentlichte Daten). Ein kürzlich veröffentlichter Bericht über diesen Ansatz weiter demonstriert seine Anwendung auf Immunantwort nach Inselzellen der Bauchspeicheldrüse Transplantation 31 studieren. Wichtig ist, dass diese Studie zeigte, dass die Transplantation in die vordere Kammer des Auges stellt eine natürliche Körper Fenster ausführen: (1) Längs-, nicht-invasiven Darstellung von transplantierten Geweben in vivo, (2) in vivo cytolabeling um zelluläre Phänotyp und Lebensfähigkeit de beurteilen situ, (3) Echtzeit-Tracking von infiltrierenden Immunzellen in das Zielgewebe, und (4) lokale Intervention durch topische Anwendung oder intraokularen Injektion.
Hier D Wiremonstrate wie Transplantation in die vordere Kammer des Auges unter Verwendung Pankreasinseln durchzuführen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Murine Pankreasinseln wurden isoliert unter Verwendung Kollagenaseverdau durch Reinigung auf Dichtegradienten gefolgt, wie zuvor beschrieben 33. Isolierten Inseln wurden über Nacht vor der Transplantation gezüchtet. Obwohl dies nicht erforderlich sein kann, wird empfohlen, damit die Inseln aus dem Isolierungsverfahren erholen. Dies ist entscheidend, wenn die Transplantation in diabetischen Empfängern durchgeführt wird, wie es der Transplantation zu überleben / robust Inseln gewährleistet.
<p class="…Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir erkennen Drs. Camillo Ricordi, Antonello Pileggi, R. Damaris Molano, Stephan Speier und Daniel Nyqvist für fruchtbare Diskussionen. Wir danken auch Eleut Hernandez und Diego Espinosa-Heidmann für die technische Unterstützung und Mike Valdes und Margaret Formoso um Hilfe mit Videoaufnahme. Byron Maldonado erfasst, bearbeitet und produziert das fertige Video. Unterstützung der Forschung wurde von der Diabetes Research Institute Foundation (vorausgesetzt www.DiabetesResearch.org ), der NIH / NIDDK / NIAID (F32DK083226 MHA; NIH RO3DK075487 zum AC; U01DK089538 um PO.B.). Weitere wissenschaftliche Unterstützung PO.B wurde durch Mittel aus dem Karolinska Institutet, dem schwedischen Research Council, dem schwedischen Diabetes Foundation, Familie Erling Persson-Stiftung, der Familie Knut and Alice Wallenberg Foundation, der Skandia Insurance Company Ltd VIBRANT vorgesehen ( FP7-228.933-2), Strategic Research Program in Diabetes am Karolinska Inst.itutet der Novo Nordisk Stiftung und der Berth von Kantzow Stiftung.
Materials
| Name of reagent | Company | Catalogue number | Description/Comments |
| IsoTHESIA (Isoflurane) | Buttler Animal Health Supply | 11695-6775-2 | 99.9% Isoflurane/ml |
| Ketaset (Ketamine HCL) | Fort dodge Animal Health | 0856-2013-01 | Alternative injectable anesthesia |
| Beprenex (Buprenorphine HCL) | Reckitt Benckiser Health Care (UK) Ltd. | 12496-075-7-1 | 0.3 mg/ml |
| Erythromycin Ophthalmic Ointment USP, 0.5% | Akron | 17478-070-35 | Applied prophylactically to transplanted eye |
| 0.9% Sodium Chloride (Saline) | Hospira Inc. | 0409-7983-03 | For iv injection. Sterile |
| PBS | Gibco | 10010-023 | 1X. Sterile |
| CMRL medium 1066 | Cellgro | 98-304-CV | Supplemented, CIT modification. Preferred media for islets |
References
- Weigert, R., Sramkova, M., Parente, L., Amornphimoltham, P., Masedunskas, A. Intravital microscopy: a novel tool to study cell biology in living animals. Histochem. Cell Biol. 133 (5), 481-491 (2010).
- Leibiger, I. B., Caicedo, A., Berggren, P. O. Non-invasive in vivo imaging of pancreatic ?-cell function and survival – a perspective. Acta Physiol. (Oxf). , (2011).
- Wang, Y., Maslov, K., Kim, C., Hu, S., Wang, L. Integrated photoacoustic and fluorescence confocal microscopy. IEEE Trans Biomed. Eng. 57 (10), 2576-2578 (2010).
- Ntziachristos, V. Going deeper than microscopy: the optical imaging frontier in biology. Nat. Methods. 7, 603-614 (2010).
- Aswathy, R. G., Yoshida, Y., Maekawa, T., Kumar, D. S. Near-infrared quantum dots for deep tissue imaging. Anal. Bioanal Chem. 397 (4), 1417-1435 (2010).
- Ghoroghchian, P. P., Therien, M. J., Hammer, D. A. In vivo fluorescence imaging: a personal perspective. Wiley Interdiscip Rev. Nanomed Nanobiotechnol. 1 (2), 156-167 (2009).
- Prescher, A., Mory, C., Martin, M., Fiedler, M., Uhlmann, D. Effect of FTY720 treatment on postischemic pancreatic microhemodynamics. Transplant Proc. 42 (10), 3984-3985 (2010).
- Leblond, F., Davis, S., Valdés, P., Pogue, B. Pre-clinical whole-body fluorescence imaging: Review of instruments, methods and applications. J. Photochem. Photobiol. B. 98 (1), 77-94 (2010).
- Toso, C., Vallee, J. P., Morel, P., Ris, F., Demuylder-Mischler, S., Lepetit-Coiffe, M., et al. Clinical magnetic resonance imaging of pancreatic islet grafts after iron nanoparticle labeling. Am. J. Transplant. 8 (3), 701-706 (2008).
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
- Wang, B. G., Konig, K., Halbhuber, K. J. Two-photon microscopy of deep intravital tissues and its merits in clinical research. J. Microsc. 238 (1), 1-20 (2010).
- Denk, W., Delaney, K. R., Gelperin, A., Kleinfeld, D., Strowbridge, B. W., Tank, D. W., et al. Anatomical and functional imaging of neurons using 2-photon laser scanning microscopy. J. Neurosci. Methods. 54 (2), 151-162 (1994).
- Cahalan, M. D., Parker, I. Choreography of cell motility and interaction dynamics imaged by two-photon microscopy in lymphoid organs. Annu. Rev. Immunol. 26, 585-626 (2008).
- Khorshidi, M. A., Vanherberghen, B., Kowalewski, J. M., Garrod, K. R., Lindstrom, S., Andersson-Svahn, H., et al. Analysis of transient migration behavior of natural killer cells imaged in situ and in vitro. Integr. Biol. (Camb). 3 (7), 770-778 (2011).
- Matheu, M. P., Cahalan, M. D., Parker, I. Immunoimaging: studying immune system dynamics using two-photon microscopy. Cold Spring Harb. Protoc. 2011, pdb.top99 (2011).
- Celli, S., Albert, M. L., Bousso, P. Visualizing the innate and adaptive immune responses underlying allograft rejection by two-photon microscopy. Nat. Med. , (2011).
- Fan, Z., Spencer, J., Lu, Y., Pitsillides, C., Singh, G., Kim, P., et al. In vivo tracking of ‘color-coded’ effector, natural and induced regulatory T cells in the allograft response. Nat. Med. 16 (6), 718-722 (2010).
- Sabek, O., Gaber, M. W., Wilson, C. M., Zawaski, J. A., Fraga, D. W., Gaber, O. Imaging of human islet vascularization using a dorsal window model. Transplant Proc. 42 (6), 2112-2114 (2010).
- Coppieters, K., Martinic, M. M., Kiosses, W. B., Amirian, N., von Herrath, M. A novel technique for the in vivo imaging of autoimmune diabetes development in the pancreas by two-photon microscopy. PLoS One. 5 (12), e15732 (2010).
- Martinic, M. M., von Herrath, M. G. Real-time imaging of the pancreas during development of diabetes. Immunol Rev. 221, 200-213 (2008).
- Mostany, R., Portera-Cailliau, C. A Method for 2-Photon Imaging of Blood Flow in the Neocortex through a Cranial Window. J. Vis. Exp. (12), e678 (2008).
- Palmer, G. M., Fontanella, A. N., Shan, S., Hanna, G., Zhang, G., Fraser, C. L., et al. In vivo optical molecular imaging and analysis in mice using dorsal window chamber models applied to hypoxia, vasculature and fluorescent. 6 (9), 1355-1366 (2011).
- Jain, R. K., Munn, L. L., Fukumura, D. Dissecting tumour pathophysiology using intravital microscopy. Nat. Rev. Cancer. 2 (4), 266-276 (2002).
- Taylor, M. The response of capillary endothelium to changes in intravascular pressure, as seen in the rabbit’s ear chamber. Aust. J. Exp. Biol. Med. Sci. 31 (5), 533-543 (1953).
- Shan, S., Sorg, B., Dewhirst, M. W. A novel rodent mammary window of orthotopic breast cancer for intravital microscopy. Microvasc. Res. 65 (2), 109-117 (2003).
- Speier, S., Nyqvist, D., Cabrera, O., Yu, J., Molano, R. D., Pileggi, A., et al. Noninvasive in vivo imaging of pancreatic islet cell biology. Nat. Med. 14 (5), 574-578 (2008).
- Speier, S., Nyqvist, D., Kohler, M., Caicedo, A., Leibiger, I. B., Berggren, P. O. Noninvasive high-resolution in vivo imaging of cell biology in the anterior chamber of the mouse eye. Nat. Protoc. 3 (8), 1278-1286 (2008).
- Falck, B. Site of production of oestrogen in the ovary of the rat. Nature. 184, 1082 (1959).
- Bickford-Wimer, P., Granholm, A. C., Bygdeman, M., Hoffer, B., Olson, L., Seiger, A., et al. Human fetal cerebellar and cortical tissue transplanted to the anterior eye chamber of athymic rats: electrophysiological and structural studies. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84 (16), 5957-5961 (1987).
- Adeghate, E., Donath, T. Morphological findings in long-term pancreatic tissue transplants in the anterior eye chamber of rats. Pancreas. 5 (3), 298-305 (1990).
- Abdulreda, M. H., Faleo, G., Molano, R. D., Lopez-Cabezas, M., Molina, J., Tan, Y., et al. High-resolution, noninvasive longitudinal live imaging of immune responses. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. , (2011).
- Unutmaz, D., Xiang, W., Sunshine, M. J., Campbell, J., Butcher, E., Littman, D. R. The primate lentiviral receptor Bonzo/STRL33 is coordinately regulated with CCR5 and its expression pattern is conserved between human and mouse. J. Immunol. 165 (6), 3284-3292 (2000).
- Pileggi, A., Molano, R. D., Berney, T., Cattan, P., Vizzardelli, C., Oliver, R., et al. Heme oxygenase-1 induction in islet cells results in protection from apoptosis and improved in vivo function after transplantation. Diabetes. 50 (9), 1983-1991 (2001).
