आंख की पूर्वकाल चैम्बर में अनुदैर्ध्य, गैर इनवेसिव ट्रांसप्लांटेशन<em> Vivo में</emवास्तविक समय में एकल कक्ष संकल्प के साथ इमेजिंग>
Summary
Intraocular प्रत्यारोपण और confocal माइक्रोस्कोपी के संयोजन एक नया दृष्टिकोण grafted ऊतकों के भीतर अनुदैर्ध्य, एकल कोशिका के संकल्प के साथ गैर इनवेसिव इमेजिंग वास्तविक समय के लिए सक्षम बनाता है<em> Vivo में</em>. हम प्रदर्शन कैसे माउस आंख की पूर्वकाल चैम्बर में अग्नाशय islets प्रत्यारोपण.
Abstract
Intravital इमेजिंग जैविक अनुसंधान के क्षेत्र में एक अनिवार्य उपकरण के रूप में उभरा है. इस प्रक्रिया में कई इमेजिंग तकनीक गैर invasively पशुओं में विभिन्न जैविक प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए विकसित किया गया है. हालांकि, मौजूदा intravital इमेजिंग रूपात्मकता में एक प्रमुख तकनीकी सीमा एकल कोशिका संकल्प क्षमताओं के साथ गैर इनवेसिव, अनुदैर्ध्य इमेजिंग गठबंधन की अक्षमता है. हम यहाँ दिखाने कैसे आंख की पूर्वकाल चैम्बर में प्रत्यारोपण के इस तरह के महत्वपूर्ण एक बहुमुखी प्रयोगात्मक मंच है कि गैर इनवेसिव, vivo में सेलुलर संकल्प के साथ अनुदैर्ध्य इमेजिंग के लिए सक्षम बनाता है की पेशकश सीमा circumvents. हम चूहे में प्रत्यारोपण प्रक्रिया प्रदर्शन और प्रतिनिधि नैदानिक प्रासंगिकता, अर्थात् अग्नाशय आइलेट प्रत्यारोपण के साथ एक मॉडल का उपयोग कर परिणाम प्रदान करते हैं. आंख की पूर्वकाल चैम्बर में प्रतिरोपित ऊतकों की एक किस्म में प्रत्यक्ष दृश्य को सक्षम करने के लिए इसके अलावा, इस दृष्टिकोण रोड़ी के लिए एक मंच प्रदान करता हैप्रदर्शन द्वारा n दवाओं लंबी अवधि का पालन करें और लक्ष्य ऊतकों में निगरानी. अपनी बहुमुखी प्रतिभा के, आँख न केवल लाभ प्रत्यारोपण उपचारों के पूर्वकाल चैम्बर में ऊतक / सेल प्रत्यारोपण के कारण, यह vivo अनुप्रयोगों में अन्य विस्तार संकेत पारगमन और कैंसर या autoimmune रोग के विकास के रूप में इस तरह के शारीरिक और pathophysiological प्रक्रियाओं का अध्ययन.
Introduction
Intravital माइक्रोस्कोपी में अग्रिम शारीरिक द्वारा इन विट्रो 1 अध्ययन में की भविष्यवाणी नहीं की घटना का पता चला है. यह रहने वाले जानवर में इन विट्रो तरीकों में पारंपरिक द्वारा प्राप्त निष्कर्ष के अनुवाद में चुनौती पर प्रकाश डाला गया. पिछले दशक में रहने वाले जानवरों में ऊतकों के दृश्य काफी इमेजिंग 2 रूपरेखा, 3, 4, 5, 6 में प्रौद्योगिकीय अग्रिमों द्वारा सुधार. यह संभव प्रयोगात्मक पशु मॉडल में आवेदन करने के लिए लक्ष्य गैर invasively ऊतकों के अनुदैर्ध्य दृश्य सक्षम के साथ vivo इमेजिंग दृष्टिकोण में एक की जरूरत को प्रेरित किया है.
चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग और पोजीट्रान उत्सर्जन tomography या bioluminescence इमेजिंग तकनीक जैसे अंगों / ऊतकों शरीर 7-8, 9 के भीतर गहरे गैर इनवेसिव इमेजिंग सक्षम है. लेकिन इन तकनीकों एकल सेल संकल्प को प्राप्त करने के उपयोग ओ के बावजूद उच्च पृष्ठभूमि संकेतों और कम स्थानिक संकल्प की वजह से कर सकते हैं,च उच्च विपरीत सामग्री या ऊतक विशेष luminescence 4. यह दो photon प्रतिदीप्ति confocal माइक्रोस्कोपी 10 के आगमन के साथ संबोधित किया. दो photon माइक्रोस्कोपी intravital इमेजिंग अध्ययन कल्पना और अभूतपूर्व विवरण 11, 12 के साथ सेलुलर घटनाओं यों के लिए सक्षम होना चाहिए. यह स्वास्थ्य और रोग 13, 14, 15, 16 में महत्वपूर्ण जैविक प्रक्रियाओं के लक्षण वर्णन करने के लिए प्रेरित किया है. जबकि अग्रणी intravital इमेजिंग अध्ययन मुख्य रूप से excised ऊतक (जैसे लिम्फ नोड्स) में vivo परिस्थितियों में "मजाक उड़ाया, अन्य अध्ययनों आक्रामक दृष्टिकोण स्वस्थानी 17, 18, 19, 20, 21 में छवि उजागर लक्ष्य ऊतकों के लिए इस्तेमाल किया है. अन्य अध्ययनों से यह भी "खिड़की कक्ष मॉडल" आक्रामक दृष्टिकोण और vivo 22, 23, 24, 25 में सीमित इमेजिंग संकल्प के साथ जुड़े सीमाओं को नाकाम करने के लिए प्रयोग किया जाता है. खिड़की चैम्बर मॉडल में, एक पारदर्शी खिड़की के साथ एक कक्ष शल्य चिकित्सा diffe में त्वचा में प्रत्यारोपितजानवर पर किराया (पृष्ठीय कान या त्वचा, स्तन वसा पैड, जिगर, आदि) स्थानों (जैसे माउस, चूहे, खरगोश). हालांकि इस दृष्टिकोण स्पष्ट रूप से उच्च संकल्प इमेजिंग vivo में सक्षम बनाता है, यह एक इनवेसिव सर्जरी की आवश्यकता चैम्बर प्रत्यारोपण करने के लिए और कई सप्ताह या 22 महीने से अधिक अनुदैर्ध्य इमेजिंग अध्ययन को पूरा करने में सक्षम नहीं हो सकता है.
यह हाल ही में प्रदर्शन किया गया है कि एक न्यूनतम इनवेसिव प्रक्रिया, आंख की पूर्वकाल चैम्बर में अर्थात् प्रत्यारोपण के साथ उच्च संकल्प confocal माइक्रोस्कोपी के संयोजन (ऐस) के रूप में एक "प्राकृतिक शरीर खिड़की" प्रदान करता है एक शक्तिशाली और बहुमुखी vivo इमेजिंग मंच 26, 27 में है. ऐस में प्रत्यारोपण पिछले कई दशकों में इस्तेमाल किया गया है ऊतकों 28, 29, 30 की एक किस्म के जैविक पहलुओं का अध्ययन करने के लिए, और अपने उच्च संकल्प इमेजिंग के साथ हाल ही में संयोजन एकल कक्ष संकल्प के साथ अग्नाशय islets के शरीर क्रिया विज्ञान का अध्ययन सक्षम गैर invasively और longitudinally <> 26, 27 का समर्थन. इस दृष्टिकोण के प्रकार के पशु मॉडल में 1 मधुमेह (अप्रकाशित डेटा) के विकास के दौरान autoimmune प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. यह भी ऐस अग्नाशय कलियों या व्यक्तिगत गुर्दे glomeruli, क्रमशः (अप्रकाशित डेटा) में रोपाई से अग्नाशय के विकास का अध्ययन करने के लिए, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से गुर्दे समारोह के अध्ययन में प्रयोग किया जाता है. हाल ही में एक रिपोर्ट इस दृष्टिकोण का उपयोग आगे अपने आवेदन अग्नाशय आइलेट 31 प्रत्यारोपण के बाद प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया का अध्ययन का प्रदर्शन किया. महत्वपूर्ण बात है, इस अध्ययन कि प्रत्यारोपण आंख की पूर्वकाल चैम्बर में पता चला एक प्राकृतिक शरीर के प्रदर्शन के लिए खिड़की प्रदान करता है: (1) अनुदैर्ध्य, vivo में प्रतिरोपित ऊतकों के गैर इनवेसिव इमेजिंग, (2) vivo में सेलुलर phenotype और व्यावहारिकता का आकलन cytolabeling स्वस्थानी, (3) लक्ष्य ऊतक में प्रतिरक्षा कोशिकाओं की घुसपैठ की वास्तविक समय ट्रैकिंग, और (4) सामयिक आवेदन या intraocular इंजेक्शन द्वारा स्थानीय हस्तक्षेप.
यहाँ, हम घemonstrate कि अग्नाशय islets का उपयोग कर आंख की पूर्वकाल चैम्बर में प्रत्यारोपण प्रदर्शन करने के लिए.
Protocol
Representative Results
Discussion
Murine अग्नाशय islets कोलैजिनेज पाचन gradients घनत्व पर शुद्धि द्वारा पीछा किया, के रूप में पहले 33 में वर्णित का उपयोग कर अलग थे. पृथक islets प्रत्यारोपण से पहले रात भर सुसंस्कृत थे. हालांकि यह आवश्यक नहीं किया जा सकत?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We acknowledge Drs. Camillo Ricordi, Antonello Pileggi, R. Damaris Molano, Stephan Speier and Daniel Nyqvist for fruitful discussions. We also thank Eleut Hernandez and Diego Espinosa-Heidmann for technical assistance, and Mike Valdes and Margaret Formoso for help with video recording. Byron Maldonado recorded, edited, and produced the final video. Research support was provided by the Diabetes Research Institute Foundation (www.DiabetesResearch.org), the NIH/NIDDK/NIAID (F32DK083226 to M.H.A.; NIH RO3DK075487 to A.C.; U01DK089538 to P-O.B.). Additional research support to P-O.B was provided through funds from the Karolinska Institutet, the Swedish Research Council, the Swedish Diabetes Foundation, the Family Erling-Persson Foundation, the Family Knut and Alice Wallenberg Foundation, the Skandia Insurance Company Ltd., VIBRANT (FP7-228933-2), Strategic Research Program in Diabetes at Karolinska Institutet, the Novo Nordisk Foundation, and the Berth von Kantzow’s Foundation.
Materials
| Name of reagent | Company | Catalogue number | Description/Comments |
| IsoTHESIA (Isoflurane) | Buttler Animal Health Supply | 11695-6775-2 | 99.9% Isoflurane/ml |
| Ketaset (Ketamine HCL) | Fort dodge Animal Health | 0856-2013-01 | Alternative injectable anesthesia |
| Beprenex (Buprenorphine HCL) | Reckitt Benckiser Health Care (UK) Ltd. | 12496-075-7-1 | 0.3 mg/ml |
| Erythromycin Ophthalmic Ointment USP, 0.5% | Akron | 17478-070-35 | Applied prophylactically to transplanted eye |
| 0.9% Sodium Chloride (Saline) | Hospira Inc. | 0409-7983-03 | For iv injection. Sterile |
| PBS | Gibco | 10010-023 | 1X. Sterile |
| CMRL medium 1066 | Cellgro | 98-304-CV | Supplemented, CIT modification. Preferred media for islets |
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