길이, 비 침습적을위한 안구의 앞쪽 상공 회의소에 이식<em> 생체에</em실시간으로 단일 셀 해상도> 영상
Summary
안구 이식 및 공 촛점 현미경을 결합 새로운 접근 방식은 이식 조직 내에서 단일 셀 해상도 세로, 비 침습적 실시간 이미징을 가능하게<em> 생체 내</em>. 우리는 마우스 눈의 앞쪽 챔버에 췌장 섬을 이식하는 방법을 보여줍니다.
Abstract
Intravital 영상은 생물학적 연구에 필수적인 도구로 떠오르고있다. 이 과정에서 많은 이미징 기술이 아닌 invasively 동물에서 다른 생물학적 과정을 연구하기 위해 개발되었습니다. 그러나, 기존의 intravital 이미징 modalities의 주요 기술적 인 제한은 단일 셀 해상도 기능으로 비 침습적, 길이 방향의 영상을 결합 할 수 없다는 것입니다. 우리는 눈 앞 챔버 내로 이식은 생체 내 세포 해상도 비 침습적, 세로 이미지 수있는 다양한 실험 플랫폼을 제공하는 등 상당한 제한을 circumvents 방법을 여기에 표시됩니다. 우리는 마우스에 이식 절차를 설명하고, 즉 임상 관련성, 췌장 췌장 이식과 모델을 사용 대표적인 결과를 제공합니다. 눈의 앞쪽 챔버 내로 이식 조직의 다양한 직접 시각화를 지원하는 것 외에도,이 방법은 애추 할 수있는 플랫폼을 제공합니다수행하여 N 약물의 장기 후속 및 대상 조직의 모니터링. 때문에 눈 혜택 이식 요법뿐만 아니라 앞쪽에 챔버로의 다양성, 조직 / 세포 이식의, 이건 정말 신호 전달과 암이나 면역 질환 개발과 같은 생리와 pathophysiological 과정을 공부하고 생체 응용 프로그램에서 다른 확장합니다.
Introduction
intravital 현미경의 발전은 체외 연구 1에 의해 예측하지 생리 현상을 보여 왔습니다. 이것은 살아있는 동물로 체외 방법에 기존하여 얻은 결과를 번역에 도전을 강조 표시합니다. 지난 10 년 간, 생활 동물 조직의 시각화는 상당히 이미징 modalities 2, 3, 4, 5, 6에 기술 진보에 의해 개선되었다. 이 비 invasively 대상 조직의 길이 방향 시각화를 사용하는 실험 동물 모델에서 가능한 응용 프로그램과 생체 이미징 접근에 대한 필요성을 가했다 있습니다.
이러한 자기 공명 영상 및 양전자 방출 단층 촬영이나 bioluminescence와 같은 이미징 기술은 신체 7-8, 9에서 깊은 장기 / 조직의 비 침습적 영상을 사용했습니다. 그러나 이러한 기술을 사용 O에도 불구하고, 높은 배경 신호와 낮은 공간 해상도로 인해 휴대 해상도 하나를 달성 할 수 없습니다F 고 대비 자료 나 조직 별 발광을 4. 이것은 두 광자 형광 공 촛점 현미경 (10)의 도래와 함께 해결되었습니다. 두 광자 현미경은 intravital 이미징 연구 시각화하고 전례가없는 세부 사항 11, 12로 휴대 이벤트를 정할 수있었습니다. 이 건강과 질병 13, 14, 15, 16의 주요 생물학적 과정의 특성을 이끌었습니다. 선구 intravital 이미징 연구가 주로 excised 조직 (예 : 림프절)의 생체 조건에서 "없잖아?"동안, 다른 연구는 시츄 17, 18, 19, 20, 21 이미지 노출 대상 조직에 침투 방법을 사용했습니다. 다른 연구는 또한 침습적 방법과 생체 22, 23, 24, 25 제한된 영상 해상도와 관련된 제한을 회피하기 위해 '창 챔버 모델 "을 사용했습니다. 창 챔버 모델에서 투명 창 챔버는 수술 diffe의 피부에 이식되어동물의 임대 위치 (등쪽이나 귀 피부, 유방 지방 패드, 간, 등) (예 : 마우스, 쥐, 토끼). 이 방법이 명확하게 생체 이미징에 높은 해상도를 수 있지만, 챔버 이식 해 침습적 수술을 필요하며 몇 주 또는 몇 달 22여 종 방향 이미징 연구를 수용 할 수없는 경우가 있습니다.
그것은 최근 눈의 앞쪽 챔버에, 즉 최소한 침략 절차, 이식과 고해상도 공 촛점 현미경을 결합하는 (ACE)로 "자연 몸 창"을 제공하는 입증 된 강력하고 생체 이미징 플랫폼 26, 27의 다양한. ACE에 이식이 조직 28, 29, 30의 다양한 생물학적 측면을 연구하기 위해 지난 몇 수십 년 동안 사용되었습니다, 그리고 고해상도 영상과의 최근 조합은 단일 셀 해상도로 췌장 섬의 생리를 공부 활성화 비 invasively 및 길이 방향 <> 26, 27 논의하게 될 것입니다. 이 방법은 동물 모델에서 제 1 형 당뇨병 (게시되지 않은 데이터)의 개발 기간 동안 면역 반응을 연구하는 데 사용되었습니다. 또한 각각 ACE의 췌장 꽃 봉오리 또는 개별 신장 glomeruli, (게시되지 않은 데이터)에 이식하여 신장 기능의 연구에서, 췌장 개발을 공부뿐만 아니라하는 데 사용되었습니다. 이 방법을 사용하는 최근의 보고서는 더 췌장 췌장 이식 31 일 이후 면역 반응을 연구하기위한 응용 프로그램을 보여 주었다. 중요한 것은,이 연구는 수행 할 천연 바디 창 제공하는 눈의 앞쪽 챔버에 그 이식을 보여 주었다 : 생체에 이식 된 조직 (1) 길이, 비 침습적 영상을, (2) 생체에서의 세포 표현형 및 생존 능력을 평가하기 위해 cytolabeling 현장, 대상 조직에 면역 세포에 침투 (3) 실시간으로 추적하고, 국소 응용 프로그램 또는 안구 내 주사로 (4) 지역 개입했습니다.
여기, 우리는 D췌장 섬을 사용하여 눈의 앞쪽 챔버 내로 이식을 수행하는 방법을 emonstrate.
Protocol
Representative Results
Discussion
손쥐 췌장 섬은 이전에 33 설명한 바와 같이, 밀도 기울기에 정화에 이어 collagenase의 소화를 사용하여 분리 하였다. 절연 섬은 이식 전에 하룻밤 배양 하였다. 이것이 필요하지 않을 수도 있지만,이 섬은 격리 절차에서 복구 할 수 있도록하는 것이 좋습니다. 가 / 강력한 섬을 생존의 이식을 보장하므로이 이식이 당뇨병 수신자에 수행 할 때 중요합니다.
이식은 산소 / i…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 Drs을 인정합니다. Camillo Ricordi, Antonello Pileggi, R. Damaris Molano, 스테판 Speier 유익한 토론 다니엘 Nyqvist. 우리는 또한 비디오 녹화와 관련하여 도움이 Eleut 헤르 난 데스와 디에고 에스피노사 – Heidmann 기술 지원 및 마이크 발데스와 마가렛 Formoso 감사드립니다. 바이런 말도 나도는 편집 기록, 최종 비디오를 제작했다. 연구 지원은 당뇨병 연구소 재단 (에서 제공 한 www.DiabetesResearch.org ), NIH / NIDDK / NIAID (MHA에 F32DK083226, AC에 대한 NIH RO3DK075487, PO.B.에 U01DK089538). PO.B에 대한 추가 연구 지원은 Karolinska Institutet, 스웨덴 연구위원회, 스웨덴 당뇨병 재단, 가족 Erling – 페르손 재단, 가족 Knut와 앨리스 발렌 버그 재단, 활기찬 Skandia 보험 회사 (주)에서 자금을 통해 제공되었다 ( Karolinska Inst에서 당뇨병의 FP7 – 228933-2), 전략적 연구 프로그램itutet, 노보 Nordisk 재단, 그리고 부두 폰 Kantzow의 재단.
Materials
| Name of reagent | Company | Catalogue number | Description/Comments |
| IsoTHESIA (Isoflurane) | Buttler Animal Health Supply | 11695-6775-2 | 99.9% Isoflurane/ml |
| Ketaset (Ketamine HCL) | Fort dodge Animal Health | 0856-2013-01 | Alternative injectable anesthesia |
| Beprenex (Buprenorphine HCL) | Reckitt Benckiser Health Care (UK) Ltd. | 12496-075-7-1 | 0.3 mg/ml |
| Erythromycin Ophthalmic Ointment USP, 0.5% | Akron | 17478-070-35 | Applied prophylactically to transplanted eye |
| 0.9% Sodium Chloride (Saline) | Hospira Inc. | 0409-7983-03 | For iv injection. Sterile |
| PBS | Gibco | 10010-023 | 1X. Sterile |
| CMRL medium 1066 | Cellgro | 98-304-CV | Supplemented, CIT modification. Preferred media for islets |
References
- Weigert, R., Sramkova, M., Parente, L., Amornphimoltham, P., Masedunskas, A. Intravital microscopy: a novel tool to study cell biology in living animals. Histochem. Cell Biol. 133 (5), 481-491 (2010).
- Leibiger, I. B., Caicedo, A., Berggren, P. O. Non-invasive in vivo imaging of pancreatic ?-cell function and survival – a perspective. Acta Physiol. (Oxf). , (2011).
- Wang, Y., Maslov, K., Kim, C., Hu, S., Wang, L. Integrated photoacoustic and fluorescence confocal microscopy. IEEE Trans Biomed. Eng. 57 (10), 2576-2578 (2010).
- Ntziachristos, V. Going deeper than microscopy: the optical imaging frontier in biology. Nat. Methods. 7, 603-614 (2010).
- Aswathy, R. G., Yoshida, Y., Maekawa, T., Kumar, D. S. Near-infrared quantum dots for deep tissue imaging. Anal. Bioanal Chem. 397 (4), 1417-1435 (2010).
- Ghoroghchian, P. P., Therien, M. J., Hammer, D. A. In vivo fluorescence imaging: a personal perspective. Wiley Interdiscip Rev. Nanomed Nanobiotechnol. 1 (2), 156-167 (2009).
- Prescher, A., Mory, C., Martin, M., Fiedler, M., Uhlmann, D. Effect of FTY720 treatment on postischemic pancreatic microhemodynamics. Transplant Proc. 42 (10), 3984-3985 (2010).
- Leblond, F., Davis, S., Valdés, P., Pogue, B. Pre-clinical whole-body fluorescence imaging: Review of instruments, methods and applications. J. Photochem. Photobiol. B. 98 (1), 77-94 (2010).
- Toso, C., Vallee, J. P., Morel, P., Ris, F., Demuylder-Mischler, S., Lepetit-Coiffe, M., et al. Clinical magnetic resonance imaging of pancreatic islet grafts after iron nanoparticle labeling. Am. J. Transplant. 8 (3), 701-706 (2008).
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
- Wang, B. G., Konig, K., Halbhuber, K. J. Two-photon microscopy of deep intravital tissues and its merits in clinical research. J. Microsc. 238 (1), 1-20 (2010).
- Denk, W., Delaney, K. R., Gelperin, A., Kleinfeld, D., Strowbridge, B. W., Tank, D. W., et al. Anatomical and functional imaging of neurons using 2-photon laser scanning microscopy. J. Neurosci. Methods. 54 (2), 151-162 (1994).
- Cahalan, M. D., Parker, I. Choreography of cell motility and interaction dynamics imaged by two-photon microscopy in lymphoid organs. Annu. Rev. Immunol. 26, 585-626 (2008).
- Khorshidi, M. A., Vanherberghen, B., Kowalewski, J. M., Garrod, K. R., Lindstrom, S., Andersson-Svahn, H., et al. Analysis of transient migration behavior of natural killer cells imaged in situ and in vitro. Integr. Biol. (Camb). 3 (7), 770-778 (2011).
- Matheu, M. P., Cahalan, M. D., Parker, I. Immunoimaging: studying immune system dynamics using two-photon microscopy. Cold Spring Harb. Protoc. 2011, pdb.top99 (2011).
- Celli, S., Albert, M. L., Bousso, P. Visualizing the innate and adaptive immune responses underlying allograft rejection by two-photon microscopy. Nat. Med. , (2011).
- Fan, Z., Spencer, J., Lu, Y., Pitsillides, C., Singh, G., Kim, P., et al. In vivo tracking of ‘color-coded’ effector, natural and induced regulatory T cells in the allograft response. Nat. Med. 16 (6), 718-722 (2010).
- Sabek, O., Gaber, M. W., Wilson, C. M., Zawaski, J. A., Fraga, D. W., Gaber, O. Imaging of human islet vascularization using a dorsal window model. Transplant Proc. 42 (6), 2112-2114 (2010).
- Coppieters, K., Martinic, M. M., Kiosses, W. B., Amirian, N., von Herrath, M. A novel technique for the in vivo imaging of autoimmune diabetes development in the pancreas by two-photon microscopy. PLoS One. 5 (12), e15732 (2010).
- Martinic, M. M., von Herrath, M. G. Real-time imaging of the pancreas during development of diabetes. Immunol Rev. 221, 200-213 (2008).
- Mostany, R., Portera-Cailliau, C. A Method for 2-Photon Imaging of Blood Flow in the Neocortex through a Cranial Window. J. Vis. Exp. (12), e678 (2008).
- Palmer, G. M., Fontanella, A. N., Shan, S., Hanna, G., Zhang, G., Fraser, C. L., et al. In vivo optical molecular imaging and analysis in mice using dorsal window chamber models applied to hypoxia, vasculature and fluorescent. 6 (9), 1355-1366 (2011).
- Jain, R. K., Munn, L. L., Fukumura, D. Dissecting tumour pathophysiology using intravital microscopy. Nat. Rev. Cancer. 2 (4), 266-276 (2002).
- Taylor, M. The response of capillary endothelium to changes in intravascular pressure, as seen in the rabbit’s ear chamber. Aust. J. Exp. Biol. Med. Sci. 31 (5), 533-543 (1953).
- Shan, S., Sorg, B., Dewhirst, M. W. A novel rodent mammary window of orthotopic breast cancer for intravital microscopy. Microvasc. Res. 65 (2), 109-117 (2003).
- Speier, S., Nyqvist, D., Cabrera, O., Yu, J., Molano, R. D., Pileggi, A., et al. Noninvasive in vivo imaging of pancreatic islet cell biology. Nat. Med. 14 (5), 574-578 (2008).
- Speier, S., Nyqvist, D., Kohler, M., Caicedo, A., Leibiger, I. B., Berggren, P. O. Noninvasive high-resolution in vivo imaging of cell biology in the anterior chamber of the mouse eye. Nat. Protoc. 3 (8), 1278-1286 (2008).
- Falck, B. Site of production of oestrogen in the ovary of the rat. Nature. 184, 1082 (1959).
- Bickford-Wimer, P., Granholm, A. C., Bygdeman, M., Hoffer, B., Olson, L., Seiger, A., et al. Human fetal cerebellar and cortical tissue transplanted to the anterior eye chamber of athymic rats: electrophysiological and structural studies. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84 (16), 5957-5961 (1987).
- Adeghate, E., Donath, T. Morphological findings in long-term pancreatic tissue transplants in the anterior eye chamber of rats. Pancreas. 5 (3), 298-305 (1990).
- Abdulreda, M. H., Faleo, G., Molano, R. D., Lopez-Cabezas, M., Molina, J., Tan, Y., et al. High-resolution, noninvasive longitudinal live imaging of immune responses. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. , (2011).
- Unutmaz, D., Xiang, W., Sunshine, M. J., Campbell, J., Butcher, E., Littman, D. R. The primate lentiviral receptor Bonzo/STRL33 is coordinately regulated with CCR5 and its expression pattern is conserved between human and mouse. J. Immunol. 165 (6), 3284-3292 (2000).
- Pileggi, A., Molano, R. D., Berney, T., Cattan, P., Vizzardelli, C., Oliver, R., et al. Heme oxygenase-1 induction in islet cells results in protection from apoptosis and improved in vivo function after transplantation. Diabetes. 50 (9), 1983-1991 (2001).
