Transplantasjon i fremre kammer av øyet for Longitudinal, Ikke-invasive<em> In vivo</em> Imaging med encellede oppløsning i sanntid
Summary
En ny tilnærming kombinere intraokulær transplantasjon og konfokalmikroskopi muliggjør langsgående, ikke-invasiv sanntids avbildning med encellede oppløsning innenfor podet vev<em> In vivo</em>. Vi viser hvordan å transplantere bukspyttkjertelen holmer i fremre kammer av musen øyet.
Abstract
Intravital bildebehandling har dukket opp som et uunnværlig verktøy i biologisk forskning. I prosessen, har mange bildedannende teknikker blitt utviklet for å studere forskjellige biologiske prosesser i dyr ikke-invasiv. Imidlertid er en stor teknisk begrensning i eksisterende intravital bildediagnostikk manglende evne til å kombinere ikke-invasiv, langsgående avbildning med encellede løsningsmuligheter. Vi viser her hvordan transplantasjon i fremre kammer av øyet omgår slik betydelig begrensning tilbyr en allsidig eksperimentell plattform som muliggjør ikke-invasiv, langsgående avbildning med cellulær oppløsning in vivo. Vi viser til transplantasjon prosedyre i musen og gi representative resultater ved hjelp av en modell med klinisk relevans, nemlig bukspyttkjertelen holme transplantasjon. I tillegg til å aktivere direkte visualisering i en rekke vev transplantert inn i fremre kammer av øyet, gir denne tilnærmingen en plattform for å rasmarkn legemidler ved å utføre langsiktig oppfølging og overvåking i målet vev. På grunn av sin fleksibilitet, vev / celle transplantasjon i fremre kammer av øyet ikke bare fordeler transplantasjon terapier, strekker det i andre in vivo applikasjoner å studere fysiologiske og patofysiologiske prosesser som signaltransduksjon og kreft eller autoimmun sykdom utvikling.
Introduction
Fremskritt i intravital mikroskopi har avdekket fysiologiske fenomener ikke spådd av in vitro studier en. Dette understreker utfordringen med å oversette funn oppnådd ved konvensjonelle in vitro metoder i levende dyr. I det siste tiåret, ble visualisering av vev i levende dyr betydelig forbedret ved teknologiske fremskritt i bildediagnostikk 2, 3, 4, 5, 6. Dette har påvirket en behov for in vivo imaging tilnærminger med gjennomførbart program i eksperimentelle dyremodeller for å muliggjøre langsgående visualisering av målvev ikke-invasiv.
Imaging-teknikker slik som magnetisk resonans imaging og positronemisjonstomografi eller Bioluminescens har aktivert ikke-invasiv avbildning av organer / vev dypt inne i kroppen 7-8, 9. Men disse teknikkene ikke kan oppnå enkelt celle-oppløsning på grunn av høy bakgrunnssignaler og lav romlig oppløsning, til tross for bruk of høy kontrast materialer eller vev-spesifikk luminescence 4. Dette ble adressert med bruk av to-foton fluorescens konfokalmikroskopi 10. To-foton mikroskopi aktivert intravital imaging studier for å visualisere og kvantifisere mobilnettet hendelser med enestående detaljer 11, 12. Dette har ført til karakterisering av sentrale biologiske prosesser i helse og sykdom 13, 14, 15, 16.. Mens banebrytende intravital imaging studier har primært "etterlignet" in vivo betingelser i excised vev (f.eks lymfeknuter), har andre studier benyttet invasive tilnærminger til bilde eksponerte målvev in situ 17, 18, 19, 20, 21. Andre studier har også brukt "vindu kammer modeller" for å omgå begrensninger knyttet invasive metoder og begrenset bildebehandling oppløsning i 22 vivo, 23, 24, 25. I vinduet kammeret modellen er et kammer med et gjennomsiktig vindu implantert inn i huden på diffeleie steder (dorsal eller øret hud, mammary fettpute, lever, osv.) på dyret (f.eks mus, rotte, kanin). Mens denne tilnærmingen klart gir høy oppløsning in vivo imaging, krever det en invasiv kirurgi for å implantere kammeret og kan ikke være i stand til å imøtekomme longitudinelle imaging studier over flere uker eller måneder 22.
Det ble nylig vist at å kombinere høy oppløsning konfokalmikroskopi med en minimal invasiv prosedyre, nemlig transplantasjon i fremre kammer av øyet (ACE) gir en "naturlig kropp vindu" som et kraftig og allsidig in vivo imaging plattform 26, 27. Transplantasjon i ACE har vært brukt i de siste årtier å studere biologiske aspekter av en rekke 28 vev, 29, 30, og dens siste kombinasjon med høy oppløsning aktivert studere fysiologi pankreatiske øyer med enkeltcelle-oppløsning ikke- invasiv og lengderetningen <sup> 26, 27. Denne tilnærmingen ble brukt til å studere autoimmune reaksjoner under utvikling av type 1 diabetes i dyremodeller (upubliserte data). Det ble også brukt til å studere bukspyttkjertelen utvikling, samt, i studier av nyrefunksjon ved transplantere inn ACE pancreatic knopper eller individuelle renale glomeruli, henholdsvis (upubliserte data). En fersk rapport ved hjelp av denne tilnærmingen ytterligere demonstrert sin søknad for å studere immunresponser etter bukspyttkjertelen holme transplantasjon 31. Viktigere, viste denne studie at transplantasjon i fremre kammer av øyet gir en naturlig kropp vindu å utføre: (1) langsgående, ikke-invasiv avbildning av transplanterte vev in vivo, (2) in vivo cytolabeling å vurdere cellulær fenotype og levedyktighet i situ, (3) sanntids sporing av infiltrerende immunceller i målvevet, og (4) lokal intervensjon ved lokal applikasjon eller intraokulær injeksjon.
Her D Viemonstrate hvordan å utføre transplantasjon i fremre kammer av øyet ved hjelp av pankreatiske øyer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Murine pankreatiske øyer ble isolert ved hjelp av kollagenase fordøyelsen etterfulgt av rensing på tetthetsgradienter, som beskrevet tidligere 33. Isolerte småøyer ble dyrket over natten før transplantasjon. Mens dette ikke kan være nødvendig, er det anbefalt å la holmene å gjenopprette fra isolasjon prosedyren. Dette er avgjørende når transplantasjon utføres i diabetiker mottakere som det vil sikre transplantasjon for å overleve / robuste holmer.
Transplantasjon utf…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi erkjenner Drs. Camillo Ricordi, Antonello Pileggi, R. Damaris Molano, Stephan Speier og Daniel Nyqvist for fruktbare diskusjoner. Vi vil også takke Eleut Hernandez og Diego Espinosa-Heidmann for teknisk assistanse, og Mike Valdes og Margaret Formoso for hjelp med videoopptak. Byron Maldonado registrert, redigert og produsert den endelige videoen. Forskningsstøtte ble gitt av Diabetes Research Institute Foundation ( www.DiabetesResearch.org ), NIH / NIDDK / NIAID (F32DK083226 til MHA, NIH RO3DK075487 til AC; U01DK089538 til PO.B.). Ytterligere forskning støtte til PO.B ble gitt gjennom midler fra Karolinska Institutet, det svenske Vetenskapsrådet, den svenske Diabetes Foundation, Family Erling-Persson Foundation, familien Knut og Alice Wallenberg Foundation, Skandia Insurance Company Ltd, VIBRANT ( FP7-228933-2), strategisk forskningsprogram i Diabetes ved Karolinska Institutet, Novo Nordisk Fonden, og Berth von Kantzow stiftelse.
Materials
| Name of reagent | Company | Catalogue number | Description/Comments |
| IsoTHESIA (Isoflurane) | Buttler Animal Health Supply | 11695-6775-2 | 99.9% Isoflurane/ml |
| Ketaset (Ketamine HCL) | Fort dodge Animal Health | 0856-2013-01 | Alternative injectable anesthesia |
| Beprenex (Buprenorphine HCL) | Reckitt Benckiser Health Care (UK) Ltd. | 12496-075-7-1 | 0.3 mg/ml |
| Erythromycin Ophthalmic Ointment USP, 0.5% | Akron | 17478-070-35 | Applied prophylactically to transplanted eye |
| 0.9% Sodium Chloride (Saline) | Hospira Inc. | 0409-7983-03 | For iv injection. Sterile |
| PBS | Gibco | 10010-023 | 1X. Sterile |
| CMRL medium 1066 | Cellgro | 98-304-CV | Supplemented, CIT modification. Preferred media for islets |
References
- Weigert, R., Sramkova, M., Parente, L., Amornphimoltham, P., Masedunskas, A. Intravital microscopy: a novel tool to study cell biology in living animals. Histochem. Cell Biol. 133 (5), 481-491 (2010).
- Leibiger, I. B., Caicedo, A., Berggren, P. O. Non-invasive in vivo imaging of pancreatic ?-cell function and survival – a perspective. Acta Physiol. (Oxf). , (2011).
- Wang, Y., Maslov, K., Kim, C., Hu, S., Wang, L. Integrated photoacoustic and fluorescence confocal microscopy. IEEE Trans Biomed. Eng. 57 (10), 2576-2578 (2010).
- Ntziachristos, V. Going deeper than microscopy: the optical imaging frontier in biology. Nat. Methods. 7, 603-614 (2010).
- Aswathy, R. G., Yoshida, Y., Maekawa, T., Kumar, D. S. Near-infrared quantum dots for deep tissue imaging. Anal. Bioanal Chem. 397 (4), 1417-1435 (2010).
- Ghoroghchian, P. P., Therien, M. J., Hammer, D. A. In vivo fluorescence imaging: a personal perspective. Wiley Interdiscip Rev. Nanomed Nanobiotechnol. 1 (2), 156-167 (2009).
- Prescher, A., Mory, C., Martin, M., Fiedler, M., Uhlmann, D. Effect of FTY720 treatment on postischemic pancreatic microhemodynamics. Transplant Proc. 42 (10), 3984-3985 (2010).
- Leblond, F., Davis, S., Valdés, P., Pogue, B. Pre-clinical whole-body fluorescence imaging: Review of instruments, methods and applications. J. Photochem. Photobiol. B. 98 (1), 77-94 (2010).
- Toso, C., Vallee, J. P., Morel, P., Ris, F., Demuylder-Mischler, S., Lepetit-Coiffe, M., et al. Clinical magnetic resonance imaging of pancreatic islet grafts after iron nanoparticle labeling. Am. J. Transplant. 8 (3), 701-706 (2008).
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
- Wang, B. G., Konig, K., Halbhuber, K. J. Two-photon microscopy of deep intravital tissues and its merits in clinical research. J. Microsc. 238 (1), 1-20 (2010).
- Denk, W., Delaney, K. R., Gelperin, A., Kleinfeld, D., Strowbridge, B. W., Tank, D. W., et al. Anatomical and functional imaging of neurons using 2-photon laser scanning microscopy. J. Neurosci. Methods. 54 (2), 151-162 (1994).
- Cahalan, M. D., Parker, I. Choreography of cell motility and interaction dynamics imaged by two-photon microscopy in lymphoid organs. Annu. Rev. Immunol. 26, 585-626 (2008).
- Khorshidi, M. A., Vanherberghen, B., Kowalewski, J. M., Garrod, K. R., Lindstrom, S., Andersson-Svahn, H., et al. Analysis of transient migration behavior of natural killer cells imaged in situ and in vitro. Integr. Biol. (Camb). 3 (7), 770-778 (2011).
- Matheu, M. P., Cahalan, M. D., Parker, I. Immunoimaging: studying immune system dynamics using two-photon microscopy. Cold Spring Harb. Protoc. 2011, pdb.top99 (2011).
- Celli, S., Albert, M. L., Bousso, P. Visualizing the innate and adaptive immune responses underlying allograft rejection by two-photon microscopy. Nat. Med. , (2011).
- Fan, Z., Spencer, J., Lu, Y., Pitsillides, C., Singh, G., Kim, P., et al. In vivo tracking of ‘color-coded’ effector, natural and induced regulatory T cells in the allograft response. Nat. Med. 16 (6), 718-722 (2010).
- Sabek, O., Gaber, M. W., Wilson, C. M., Zawaski, J. A., Fraga, D. W., Gaber, O. Imaging of human islet vascularization using a dorsal window model. Transplant Proc. 42 (6), 2112-2114 (2010).
- Coppieters, K., Martinic, M. M., Kiosses, W. B., Amirian, N., von Herrath, M. A novel technique for the in vivo imaging of autoimmune diabetes development in the pancreas by two-photon microscopy. PLoS One. 5 (12), e15732 (2010).
- Martinic, M. M., von Herrath, M. G. Real-time imaging of the pancreas during development of diabetes. Immunol Rev. 221, 200-213 (2008).
- Mostany, R., Portera-Cailliau, C. A Method for 2-Photon Imaging of Blood Flow in the Neocortex through a Cranial Window. J. Vis. Exp. (12), e678 (2008).
- Palmer, G. M., Fontanella, A. N., Shan, S., Hanna, G., Zhang, G., Fraser, C. L., et al. In vivo optical molecular imaging and analysis in mice using dorsal window chamber models applied to hypoxia, vasculature and fluorescent. 6 (9), 1355-1366 (2011).
- Jain, R. K., Munn, L. L., Fukumura, D. Dissecting tumour pathophysiology using intravital microscopy. Nat. Rev. Cancer. 2 (4), 266-276 (2002).
- Taylor, M. The response of capillary endothelium to changes in intravascular pressure, as seen in the rabbit’s ear chamber. Aust. J. Exp. Biol. Med. Sci. 31 (5), 533-543 (1953).
- Shan, S., Sorg, B., Dewhirst, M. W. A novel rodent mammary window of orthotopic breast cancer for intravital microscopy. Microvasc. Res. 65 (2), 109-117 (2003).
- Speier, S., Nyqvist, D., Cabrera, O., Yu, J., Molano, R. D., Pileggi, A., et al. Noninvasive in vivo imaging of pancreatic islet cell biology. Nat. Med. 14 (5), 574-578 (2008).
- Speier, S., Nyqvist, D., Kohler, M., Caicedo, A., Leibiger, I. B., Berggren, P. O. Noninvasive high-resolution in vivo imaging of cell biology in the anterior chamber of the mouse eye. Nat. Protoc. 3 (8), 1278-1286 (2008).
- Falck, B. Site of production of oestrogen in the ovary of the rat. Nature. 184, 1082 (1959).
- Bickford-Wimer, P., Granholm, A. C., Bygdeman, M., Hoffer, B., Olson, L., Seiger, A., et al. Human fetal cerebellar and cortical tissue transplanted to the anterior eye chamber of athymic rats: electrophysiological and structural studies. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84 (16), 5957-5961 (1987).
- Adeghate, E., Donath, T. Morphological findings in long-term pancreatic tissue transplants in the anterior eye chamber of rats. Pancreas. 5 (3), 298-305 (1990).
- Abdulreda, M. H., Faleo, G., Molano, R. D., Lopez-Cabezas, M., Molina, J., Tan, Y., et al. High-resolution, noninvasive longitudinal live imaging of immune responses. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. , (2011).
- Unutmaz, D., Xiang, W., Sunshine, M. J., Campbell, J., Butcher, E., Littman, D. R. The primate lentiviral receptor Bonzo/STRL33 is coordinately regulated with CCR5 and its expression pattern is conserved between human and mouse. J. Immunol. 165 (6), 3284-3292 (2000).
- Pileggi, A., Molano, R. D., Berney, T., Cattan, P., Vizzardelli, C., Oliver, R., et al. Heme oxygenase-1 induction in islet cells results in protection from apoptosis and improved in vivo function after transplantation. Diabetes. 50 (9), 1983-1991 (2001).
