Trasplante en la cámara anterior del ojo para Longitudinal, no invasiva<em> En vivo</em> Imagen con una sola célula de resolución en tiempo real
Summary
Un nuevo enfoque de la combinación de trasplante intraocular y microscopía confocal permite longitudinal, no invasiva imágenes en tiempo real con una sola célula de resolución dentro de los tejidos injertados<em> In vivo</em>. Se demuestra cómo trasplantar islotes pancreáticos en la cámara anterior del ojo del ratón.
Abstract
Intravital de imágenes se ha convertido en una herramienta indispensable en la investigación biológica. En el proceso, muchas técnicas de imagen se han desarrollado para estudiar los diferentes procesos biológicos en los animales no invasiva. Sin embargo, una limitación técnica importante en existentes modalidades de imagen intravital es la incapacidad para combinar la no-invasivo, formación de imágenes longitudinal con capacidades de resolución de una sola célula. Se muestra aquí cómo el trasplante a la cámara anterior del ojo elude esta limitación significativa que ofrece una plataforma versátil experimental que permite no invasiva, la imagen longitudinal con resolución celular in vivo. Se demuestra el procedimiento de trasplante en el ratón y proporcionar resultados representativos usando un modelo con relevancia clínica, es decir, trasplante de islotes pancreáticos. Además de permitir la visualización directa en una variedad de tejidos trasplantados en la cámara anterior del ojo, este enfoque proporciona una plataforma para Screen mediante la realización de las drogas a largo plazo de seguimiento y monitoreo en los tejidos diana. Debido a su versatilidad, el tejido / trasplante de células en la cámara anterior del ojo no sólo terapias de trasplante beneficios, se extiende a otras aplicaciones de vivo para estudiar los procesos fisiológicos y fisiopatológicos tales como la transducción de señales y el cáncer o desarrollo de la enfermedad autoinmune.
Introduction
Los avances en microscopía intravital han revelado fenómenos fisiológicos no predichas por los estudios in vitro 1. Esto pone de relieve el desafío en la traducción de los resultados obtenidos por los métodos in vitro convencional en el animal vivo. En la última década, la visualización de los tejidos en los animales vivos se mejoró considerablemente por los avances tecnológicos en las modalidades de imagen 2, 3, 4, 5, 6. Esto ha estimulado la necesidad de enfoques en formación de imágenes in vivo con aplicación factible en modelos animales experimentales para permitir la visualización longitudinal de los tejidos diana de manera no invasiva.
Las técnicas de imagen como la resonancia magnética y la tomografía por emisión de positrones o bioluminiscencia han permitido que la imagen no invasiva de órganos / tejidos profundos dentro del cuerpo 7-8, 9. Pero estas técnicas no pueden lograr células únicas resolución debido a señales de fondo elevadas y baja resolución espacial, a pesar del uso of materiales de alto contraste o 4 tejidos específicos de luminiscencia. Esto fue tratada con la llegada de dos fotones microscopía de fluorescencia confocal 10. Dos fotones microscopía intravital permitió estudios de formación de imágenes para visualizar y cuantificar acontecimientos celulares con detalles sin precedentes 11, 12. Esto ha llevado a la caracterización de procesos biológicos esenciales en la salud y la enfermedad 13, 14, 15, 16. Mientras pioneros estudios de imagen han intravital principalmente "imitado" en condiciones in vivo en los tejidos extirpados (ganglios linfáticos, por ejemplo), otros estudios han utilizado métodos invasivos para los tejidos diana de imagen expuestos in situ 17, 18, 19, 20, 21. Otros estudios también han utilizado modelos de cámara "ventana" para eludir las limitaciones asociadas con los métodos invasivos y resolución de imágenes limitado en vivo 22, 23, 24, 25. En el modelo de cámara de ventana, una cámara con una ventana transparente se implanta quirúrgicamente en la piel en difeubicaciones de alquiler (piel dorsal o el oído, almohadilla de grasa mamaria, hígado, etc) sobre el animal (por ejemplo, ratón, rata, conejo). Si bien este enfoque claramente permite una alta resolución de imágenes in vivo, se requiere una cirugía invasiva para implantar la cámara y no puede ser capaz de acomodar los estudios longitudinales de imagen durante varias semanas o meses 22.
Se ha demostrado recientemente que la combinación de alta resolución de la microscopía confocal con un procedimiento mínimamente invasivo, es decir, el trasplante a la cámara anterior del ojo (ACE) proporciona una "ventana cuerpo natural" como un. Potente y versátil en vivo plataforma de imágenes 26, 27 El trasplante en el ACE se ha utilizado en las últimas décadas para estudiar aspectos biológicos de una variedad de tejidos 28, 29, 30, y su combinación reciente con imágenes de alta resolución permitió el estudio de la fisiología de los islotes pancreáticos con células únicas resolución no invasiva y longitudinalmente <sup> 26, 27. Este enfoque se utilizó para estudiar las respuestas autoinmunes durante el desarrollo de la diabetes tipo 1 en modelos animales (datos no publicados). También fue utilizado para estudiar el desarrollo de páncreas, así como, en los estudios de la función renal mediante el trasplante en las yemas de páncreas ECA o individuales glomérulos renales, respectivamente (datos no publicados). Un reciente informe utilizando este enfoque demostró además su solicitud para estudiar la respuesta inmune después de trasplante de islotes pancreáticos 31. Es importante destacar que, este estudio demostró que el trasplante a la cámara anterior del ojo proporciona una ventana natural del cuerpo para llevar a cabo: (1) longitudinal, la imagen no invasiva de tejidos trasplantados in vivo, (2) in vivo cytolabeling para evaluar el fenotipo celular y la viabilidad en situ, (3) seguimiento en tiempo real de la infiltración de células inmunes en el tejido diana, y (4) la intervención local por aplicación tópica o inyección intraocular.
En este sentido, demonstrate cómo realizar el trasplante en la cámara anterior del ojo utilizando islotes pancreáticos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Islotes pancreáticos de murino fueron aisladas utilizando digestión con colagenasa seguido por purificación en gradientes de densidad, como se ha descrito previamente 33. Islotes aislados se cultivaron durante la noche antes del trasplante. Si bien esto puede no ser necesario, se recomienda para permitir que los islotes de recuperarse del procedimiento de aislamiento. Esto es crítico cuando se realiza el trasplante en los receptores diabéticos, ya que garantizará el trasplante de islotes sobrevivientes …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Reconocemos los Dres. Camillo Ricordi, Pileggi Antonello, R. Damaris Molano, Speier Esteban y Daniel Nyqvist para un debate fructífero. También damos las gracias Eleut Diego Hernández y Espinosa-Heidmann de asistencia técnica, y Mike Valdes y Formoso Margaret ayuda con grabación de video. Byron Maldonado grabado, editado y producido el vídeo final. Apoyo a la investigación fue proporcionada por el Instituto de Investigación de Diabetes Foundation ( www.DiabetesResearch.org ), el NIH / NIDDK / NIAID (F32DK083226 a MHA, NIH RO3DK075487 a AC; U01DK089538 a PO.B.). Apoyo a la investigación adicional para PO.B se proporciona a través de los fondos del Instituto Karolinska, el sueco Consejo de Investigación, la Fundación para la Diabetes sueca, la Fundación de la Familia Erling Persson-, la Familia Knut y Alice Wallenberg Foundation, el Skandia Insurance Company Ltd., vibrante ( FP7-228933-2), Programa Estratégico de Investigación en Diabetes en el Karolinska Inst.itutet, la Fundación Novo Nordisk, y la Fundación de amarre von Kantzow.
Materials
| Name of reagent | Company | Catalogue number | Description/Comments |
| IsoTHESIA (Isoflurane) | Buttler Animal Health Supply | 11695-6775-2 | 99.9% Isoflurane/ml |
| Ketaset (Ketamine HCL) | Fort dodge Animal Health | 0856-2013-01 | Alternative injectable anesthesia |
| Beprenex (Buprenorphine HCL) | Reckitt Benckiser Health Care (UK) Ltd. | 12496-075-7-1 | 0.3 mg/ml |
| Erythromycin Ophthalmic Ointment USP, 0.5% | Akron | 17478-070-35 | Applied prophylactically to transplanted eye |
| 0.9% Sodium Chloride (Saline) | Hospira Inc. | 0409-7983-03 | For iv injection. Sterile |
| PBS | Gibco | 10010-023 | 1X. Sterile |
| CMRL medium 1066 | Cellgro | 98-304-CV | Supplemented, CIT modification. Preferred media for islets |
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