Transplantation in i den främre ögonkammaren för längsgående, icke-invasiv<em> In vivo</em> Imaging med encelliga Upplösning i realtid
Summary
En ny strategi som kombinerar intraokulär transplantation och konfokalmikroskopi möjliggör longitudinell, icke-invasiv realtid avbildning med encelliga upplösning inom ympade vävnad<em> In vivo</em>. Vi visar hur man transplantera pankreasöar in i den främre kammaren av musen ögat.
Abstract
Intravital avbildning har blivit ett oumbärligt verktyg i biologisk forskning. I processen har många avbildningstekniker utvecklats för att studera olika biologiska processer i djur icke-invasivt. Dock är en stor teknisk begränsning i befintliga intravital avbildningsmetoder oförmågan att kombinera icke-invasiv, längsgående avbildning med encelliga upplösning kapacitet. Vi visar här hur transplantation till den främre kammaren i ögat kringgår sådana betydande begränsning som erbjuder en mångsidig experimentell plattform som möjliggör icke-invasiv, längsgående avbildning med cellulär upplösning in vivo. Vi visar transplantationen förfarandet i mus och ger representativa resultat med användning av en modell med klinisk relevans, nämligen pankreasö transplantation. Förutom att möjliggöra direkt visualisering i olika vävnader transplanteras in i den främre kammaren i ögat, ger detta tillvägagångssätt en plattform för att screen droger genom att utföra en långsiktig uppföljning och övervakning i målvävnader. På grund av sin mångsidighet, vävnad / celltransplantation i den främre kammaren i ögat inte bara gynnar transplantation behandlingar sträcker den till andra in vivo-applikationer för att studera fysiologiska och patofysiologiska processer såsom signaltransduktion och cancer eller autoimmun sjukdom utvecklas.
Introduction
Framsteg inom intravital mikroskopi har visat fysiologiska fenomen inte förutsägas med in vitro-studier 1. Detta belyser utmaningen att omvandla resultat som erhållits genom konventionell in vitro-metoder i levande djur. Under det senaste decenniet har visualisering av vävnader i levande djur avsevärt förbättras genom tekniska framsteg i avbildningsmetoder 2, 3, 4, 5, 6. Detta har lett till en behovet av in vivo avbildning med möjlig tillämpning i experimentella djurmodeller för att möjliggöra longitudinell visualisering av målvävnader icke-invasivt.
Avbildningstekniker såsom magnetisk resonanstomografi och positronemissionstomografi eller bioluminiscens har möjliggjort icke-invasiv avbildning av organ / vävnader djupt i kroppen 7-8, 9. Men dessa tekniker inte kan uppnå enskild cell upplösning på grund av höga bakgrundssignaler och låg rumslig upplösning, trots användningen of hög kontrast material eller vävnadsspecifik luminiscens 4. Detta togs upp med tillkomsten av två-foton fluorescens konfokalmikroskopi 10. Två-foton mikroskopi aktiverat intravital imaging studier för att visualisera och kvantifiera cellulära händelser med oöverträffad detaljer 11, 12. Detta har lett till karakterisering av viktiga biologiska processer i hälsa och sjukdom 13, 14, 15, 16. Medan banbrytande intravital avbildande studier har primärt "härmade" in vivo förhållanden i exciderad vävnad (t.ex. lymfkörtlar), har andra studier använt invasiva metoder för att avbilda exponerade målvävnader in situ 17, 18, 19, 20, 21. Andra studier har också använt "modeller fönster kammare" för att kringgå begränsningar som är förknippade med invasiva metoder och begränsad avbildning upplösning in vivo 22, 23, 24, 25. I fönstret kammaren modellen är en kammare med ett transparent fönster kirurgiskt implanteras i huden vid diffehyra platser (dorsala eller öra hud, bröst fettkudden, lever, etc.) på djuret (t.ex. mus, råtta, kanin). Medan detta tillvägagångssätt tydligt möjliggör hög upplösning avbildning in vivo, krävs en invasiv kirurgi för att implantera kammaren och kanske inte kan ta emot longitudinella avbildande studier över flera veckor eller månader 22.
Det har nyligen visats att kombinera hög upplösning konfokalmikroskopi med en minimalt invasiv förfarande, nämligen transplantation till den främre kammaren i ögat (ACE) ger en "naturlig kropp fönster" som en kraftfull och mångsidig in vivo imaging plattform 26, 27. Transplantation till ACE har använts under de senaste decennierna för att studera biologiska aspekter av olika vävnader 28, 29, 30, och den nyligen kombination med hög upplösning avbildning aktiverat studera fysiologi pankreasöar med enda cell upplösning icke- invasivt och longitudinellt <sup> 26, 27. Detta tillvägagångssätt användes för att studera autoimmuna reaktioner under utvecklingen av typ 1-diabetes i djurmodeller (opublicerade data). Den användes också för att studera pankreatisk utveckling, liksom, i studier av njurfunktionen genom att transplantera in ACE pankreatiska knoppar eller enskilda renala glomeruli, respektive (opublicerade data). En färsk rapport använder denna metod visade ytterligare dess tillämpning för att studera immunsvar efter pankreasöar transplantation 31. Viktigt visade denna studie att transplantation till den främre kammaren i ögat ger en naturlig kropp fönster att utföra: (1) längsgående, icke-invasiv avbildning av transplanterade vävnader in vivo, (2) in vivo cytolabeling bedöma cellulär fenotyp och livskraft situ, (3) i realtid spårning av infiltrerande immunceller i målvävnaden, och (4) lokal ingripande genom topisk applikation eller intraokulär injektion.
Här Ð viemonstrate hur man utför transplantation in den främre kammaren i ögat med pankreasöar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Murina pankreasöar isolerades med användning kollagenasdigerering följt av rening på densitetsgradienter, såsom beskrivits tidigare 33. Isolerade öar odlades över natten före transplantation. Även om detta inte kan krävas, är det rekommenderat att låta cellöarna att återhämta sig från isoleringsförfarandet. Detta är viktigt när transplantation utförs i diabetiska mottagare eftersom det kommer att se transplantation att överleva / robusta holmar.
Transplantatio…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi erkänner Dr. Camillo Ricordi, Antonello Pileggi, R. Damaris Molano, Stephan Speier och Daniel Nyqvist för givande diskussioner. Vi tackar också Eleut Hernandez och Diego Espinosa-Heidmann för tekniskt bistånd, och Mike Valdes och Margaret Formoso för hjälp med videoinspelning. Byron Maldonado in, redigeras och producerade den sista videon. Forskningsstöd gavs av Diabetes Research Institute Foundation ( www.DiabetesResearch.org ), NIH / NIDDK / NIAID (F32DK083226 till MHA, NIH RO3DK075487 till AC, U01DK089538 till PO.B.). Ytterligare forskning stöd till PO.B gavs genom medel från Karolinska Institutet, Svenska Vetenskapsrådet, Svenska Diabetes Foundation, familjen Erling-Perssons stiftelse, familjen Knut och Alice Wallenbergs Stiftelse, Skandia Insurance Company Ltd, levande ( FP7-228.933-2), strategiska forskningsprogram i diabetes vid Karolinska Institutet, Novo Nordisk Foundation och Berth von Kantzow Stiftelse.
Materials
| Name of reagent | Company | Catalogue number | Description/Comments |
| IsoTHESIA (Isoflurane) | Buttler Animal Health Supply | 11695-6775-2 | 99.9% Isoflurane/ml |
| Ketaset (Ketamine HCL) | Fort dodge Animal Health | 0856-2013-01 | Alternative injectable anesthesia |
| Beprenex (Buprenorphine HCL) | Reckitt Benckiser Health Care (UK) Ltd. | 12496-075-7-1 | 0.3 mg/ml |
| Erythromycin Ophthalmic Ointment USP, 0.5% | Akron | 17478-070-35 | Applied prophylactically to transplanted eye |
| 0.9% Sodium Chloride (Saline) | Hospira Inc. | 0409-7983-03 | For iv injection. Sterile |
| PBS | Gibco | 10010-023 | 1X. Sterile |
| CMRL medium 1066 | Cellgro | 98-304-CV | Supplemented, CIT modification. Preferred media for islets |
References
- Weigert, R., Sramkova, M., Parente, L., Amornphimoltham, P., Masedunskas, A. Intravital microscopy: a novel tool to study cell biology in living animals. Histochem. Cell Biol. 133 (5), 481-491 (2010).
- Leibiger, I. B., Caicedo, A., Berggren, P. O. Non-invasive in vivo imaging of pancreatic ?-cell function and survival – a perspective. Acta Physiol. (Oxf). , (2011).
- Wang, Y., Maslov, K., Kim, C., Hu, S., Wang, L. Integrated photoacoustic and fluorescence confocal microscopy. IEEE Trans Biomed. Eng. 57 (10), 2576-2578 (2010).
- Ntziachristos, V. Going deeper than microscopy: the optical imaging frontier in biology. Nat. Methods. 7, 603-614 (2010).
- Aswathy, R. G., Yoshida, Y., Maekawa, T., Kumar, D. S. Near-infrared quantum dots for deep tissue imaging. Anal. Bioanal Chem. 397 (4), 1417-1435 (2010).
- Ghoroghchian, P. P., Therien, M. J., Hammer, D. A. In vivo fluorescence imaging: a personal perspective. Wiley Interdiscip Rev. Nanomed Nanobiotechnol. 1 (2), 156-167 (2009).
- Prescher, A., Mory, C., Martin, M., Fiedler, M., Uhlmann, D. Effect of FTY720 treatment on postischemic pancreatic microhemodynamics. Transplant Proc. 42 (10), 3984-3985 (2010).
- Leblond, F., Davis, S., Valdés, P., Pogue, B. Pre-clinical whole-body fluorescence imaging: Review of instruments, methods and applications. J. Photochem. Photobiol. B. 98 (1), 77-94 (2010).
- Toso, C., Vallee, J. P., Morel, P., Ris, F., Demuylder-Mischler, S., Lepetit-Coiffe, M., et al. Clinical magnetic resonance imaging of pancreatic islet grafts after iron nanoparticle labeling. Am. J. Transplant. 8 (3), 701-706 (2008).
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
- Wang, B. G., Konig, K., Halbhuber, K. J. Two-photon microscopy of deep intravital tissues and its merits in clinical research. J. Microsc. 238 (1), 1-20 (2010).
- Denk, W., Delaney, K. R., Gelperin, A., Kleinfeld, D., Strowbridge, B. W., Tank, D. W., et al. Anatomical and functional imaging of neurons using 2-photon laser scanning microscopy. J. Neurosci. Methods. 54 (2), 151-162 (1994).
- Cahalan, M. D., Parker, I. Choreography of cell motility and interaction dynamics imaged by two-photon microscopy in lymphoid organs. Annu. Rev. Immunol. 26, 585-626 (2008).
- Khorshidi, M. A., Vanherberghen, B., Kowalewski, J. M., Garrod, K. R., Lindstrom, S., Andersson-Svahn, H., et al. Analysis of transient migration behavior of natural killer cells imaged in situ and in vitro. Integr. Biol. (Camb). 3 (7), 770-778 (2011).
- Matheu, M. P., Cahalan, M. D., Parker, I. Immunoimaging: studying immune system dynamics using two-photon microscopy. Cold Spring Harb. Protoc. 2011, pdb.top99 (2011).
- Celli, S., Albert, M. L., Bousso, P. Visualizing the innate and adaptive immune responses underlying allograft rejection by two-photon microscopy. Nat. Med. , (2011).
- Fan, Z., Spencer, J., Lu, Y., Pitsillides, C., Singh, G., Kim, P., et al. In vivo tracking of ‘color-coded’ effector, natural and induced regulatory T cells in the allograft response. Nat. Med. 16 (6), 718-722 (2010).
- Sabek, O., Gaber, M. W., Wilson, C. M., Zawaski, J. A., Fraga, D. W., Gaber, O. Imaging of human islet vascularization using a dorsal window model. Transplant Proc. 42 (6), 2112-2114 (2010).
- Coppieters, K., Martinic, M. M., Kiosses, W. B., Amirian, N., von Herrath, M. A novel technique for the in vivo imaging of autoimmune diabetes development in the pancreas by two-photon microscopy. PLoS One. 5 (12), e15732 (2010).
- Martinic, M. M., von Herrath, M. G. Real-time imaging of the pancreas during development of diabetes. Immunol Rev. 221, 200-213 (2008).
- Mostany, R., Portera-Cailliau, C. A Method for 2-Photon Imaging of Blood Flow in the Neocortex through a Cranial Window. J. Vis. Exp. (12), e678 (2008).
- Palmer, G. M., Fontanella, A. N., Shan, S., Hanna, G., Zhang, G., Fraser, C. L., et al. In vivo optical molecular imaging and analysis in mice using dorsal window chamber models applied to hypoxia, vasculature and fluorescent. 6 (9), 1355-1366 (2011).
- Jain, R. K., Munn, L. L., Fukumura, D. Dissecting tumour pathophysiology using intravital microscopy. Nat. Rev. Cancer. 2 (4), 266-276 (2002).
- Taylor, M. The response of capillary endothelium to changes in intravascular pressure, as seen in the rabbit’s ear chamber. Aust. J. Exp. Biol. Med. Sci. 31 (5), 533-543 (1953).
- Shan, S., Sorg, B., Dewhirst, M. W. A novel rodent mammary window of orthotopic breast cancer for intravital microscopy. Microvasc. Res. 65 (2), 109-117 (2003).
- Speier, S., Nyqvist, D., Cabrera, O., Yu, J., Molano, R. D., Pileggi, A., et al. Noninvasive in vivo imaging of pancreatic islet cell biology. Nat. Med. 14 (5), 574-578 (2008).
- Speier, S., Nyqvist, D., Kohler, M., Caicedo, A., Leibiger, I. B., Berggren, P. O. Noninvasive high-resolution in vivo imaging of cell biology in the anterior chamber of the mouse eye. Nat. Protoc. 3 (8), 1278-1286 (2008).
- Falck, B. Site of production of oestrogen in the ovary of the rat. Nature. 184, 1082 (1959).
- Bickford-Wimer, P., Granholm, A. C., Bygdeman, M., Hoffer, B., Olson, L., Seiger, A., et al. Human fetal cerebellar and cortical tissue transplanted to the anterior eye chamber of athymic rats: electrophysiological and structural studies. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84 (16), 5957-5961 (1987).
- Adeghate, E., Donath, T. Morphological findings in long-term pancreatic tissue transplants in the anterior eye chamber of rats. Pancreas. 5 (3), 298-305 (1990).
- Abdulreda, M. H., Faleo, G., Molano, R. D., Lopez-Cabezas, M., Molina, J., Tan, Y., et al. High-resolution, noninvasive longitudinal live imaging of immune responses. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. , (2011).
- Unutmaz, D., Xiang, W., Sunshine, M. J., Campbell, J., Butcher, E., Littman, D. R. The primate lentiviral receptor Bonzo/STRL33 is coordinately regulated with CCR5 and its expression pattern is conserved between human and mouse. J. Immunol. 165 (6), 3284-3292 (2000).
- Pileggi, A., Molano, R. D., Berney, T., Cattan, P., Vizzardelli, C., Oliver, R., et al. Heme oxygenase-1 induction in islet cells results in protection from apoptosis and improved in vivo function after transplantation. Diabetes. 50 (9), 1983-1991 (2001).
