Microdissezione laser di neuroni da cellule differenziate Neuroprogenitor umani in coltura
Summary
Cellule neuroprogenitor umane (NPC) sono stati ampliati in condizioni proliferanti. NPC sono stati differenziati in colture ricche di neuroni in presenza di una combinazione di neurotrofine. Marcatori neuronali sono state rilevate mediante immunofluorescenza. Per isolare una popolazione pura di neuroni, NPC sono stati differenziati sulla penna scivoli di membrana e cattura microdissezione laser è stata eseguita.
Abstract
Cellule Neuroprogenitor (NPC) isolati dal cervello fetale umano sono stati espansi in condizioni proliferative in presenza del fattore di crescita epidermico (EGF) e fattore di crescita dei fibroblasti (FGF) per fornire un rifornimento abbondante di cellule. NPC sono state differenziate in presenza di una nuova combinazione di fattore di crescita nervosa (NGF), cervello-derivato fattore neurotrofico (BDNF), dibutirril cAMP (DBC) e acido retinoico su piatti rivestito con poli-L-lisina e mouse laminina per ottenere neurone -ricche culture. NPC sono stati differenziati anche in assenza di neurotrofine, DBC e acido retinoico e in presenza di fattore neurotrofico ciliare (CNTF) per produrre colture ricche di astrociti. NPC dissociati sono stati caratterizzati da immunofluorescenza per un pannello di marcatori neuronali tra cui NeuN, synapsin, acetilcolinesterasi, synaptophysin e GAP43. Proteina acidica fibrillare gliale (GFAP) e STAT3, marcatori astrociti, sono stati rilevati nel 10-15% dei NPC differenziati. Per facilitaretipo cellulare caratterizzazione molecolare specifico, cattura microdissezione laser è stata eseguita per isolare neuroni coltivati su polietilennaftalato (PEN) scorre membrana. I metodi descritti in questo studio forniscono strumenti preziosi per far progredire la nostra comprensione dei meccanismi molecolari della neurodegenerazione.
Introduction
Vita lunga neurogenesi si verifica nella zona subventricular dei ventricoli laterali e nello strato subgranulare del giro dentato dell'adulto cervello dei mammiferi 1. Cellule Neuroprogenitor (NPC) che provengono da queste regioni sono cellule multipotenti che possono differenziarsi in neuroni, astrociti e oligodendrociti 2. NPC hanno generato interesse a causa del loro potenziale per essere trapiantate nei pazienti affetti da varie patologie neurodegenerative tra cui il morbo di Parkinson, la sclerosi laterale amiotrofica, ictus e malattie (AD) 3 di Alzheimer. Studi con NPC sono generalmente concentrati su questo angolo trapianto ma il potenziale di neuroni NPC-derivati come modello di coltura cellulare per determinare il meccanismo di neurodegenerazione non è stato sfruttato appieno. Studi precedenti hanno generalmente utilizzato neuroni post-mitotici isolate da tessuti cerebrali roditore che devono essere isolati per ogni esperimento in quanto non sonoauto-rigenerante. Anche se le linee di cellule di neuroblastoma umano SH-SY5Y compreso e le cellule SK-N-MC può essere ampliato, non hanno le caratteristiche di neuroni primari. NPC umani, invece, offrono vantaggi sia perché possono essere espansi per passaggi multipli e possono essere differenziate per generare una popolazione di cellule con le caratteristiche di neuroni primari 4,5. In questo studio, descriviamo un nuovo protocollo di differenziazione per ottenere una popolazione ricca di neuroni coerente da NPC disponibili in commercio isolati da cervello fetale umano. Poiché queste culture contengono una piccola percentuale di cellule gliali, dobbiamo metodi aggiuntivi per isolare una popolazione pura di neuroni per la caratterizzazione molecolare. Microdissezione laser (LCM) è un romanzo tecnica mediante la quale una popolazione omogenea di cellule da una sezione di tessuto può essere selettivamente catturato per analisi di espressione genica 6. Il cervello è un tessuto eterogeneo costituito da neuroni, glia e altri ty cellapes. LCM è stato usato per determinare l'espressione genica specifica del neurone analisi 7-10. Abbiamo già effettuato LCM di neuroni dell'ippocampo da AD (Tg2576) sezioni di cervello del mouse per visualizzare diminuita espressione di ciclico elemento di risposta AMP binding protein (CREB) e BDNF specificamente in neuroni dell'ippocampo 11. Nel presente studio, si descrivono le procedure per l'espansione della NPC umani, la differenziazione neuronale, immunofluorescenza per i marcatori neuronali e LCM per l'isolamento dei neuroni coltivati su PENNA diapositive membrana.
Protocol
Representative Results
Discussion
Descriviamo in questo studio un ricco di neurone modello di coltura cellulare per la differenziazione delle cellule autorinnovanti neuroprogenitor umani e un metodo per isolare una popolazione pura di neuroni cattura microdissezione laser. Abbiamo utilizzato una combinazione di NGF, BDNF, DBC e acido retinoico per la differenziazione neuronale di NPC. DBC viene utilizzato per attivare CREB, un fattore di trascrizione che migliora neurogenesi 12. L'acido retinoico induce uscita dal ciclo cellulare e riduce…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dalla concessione Merit Review (NEUD-004-07F) dal Veterans Administration (SP).
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Neuroprogenitor cells (NPCs) | Lonza | PT-2599 | |
| Neurocult NS-A human basal medium | Stem cell technology | 5750 | |
| Neurocult NS-A Proliferation supplement | Stem cell technology | 5753 | |
| Neurocult NS-A Differentiation supplement | Stem cell technology | 5754 | |
| B-27 Supplement (50x) | Invitrogen | 17504-044 | |
| Human epidermal growth factor | Stem cell technology | 2633 | |
| Fibroblast growth factor | Sigma | F0291 | |
| Brain Derived Neurotrophic Factor | Cell signaling | 3897S | |
| Nerve Growth Factor | Invitrogen | 13257-019 | |
| Dibutyryl cyclic AMP | Sigma | D-0627 | |
| poly-L-lysine | Sigma | P-5899 | |
| Mouse laminin | Sigma | L-2020 | |
| Retinoic acid | Sigma | R-2625 | |
| STAT3 antibody | Cell signaling | 9132 | |
| GFAP antibody | Cell signaling | 3670 | |
| GAP43 antibody | Transduction laboratories | 612262 | |
| BDNF antibody | Millipore | AB1534SP | |
| Acetyl cholinesterase antibody | Santz cruz | Sc-11409 | |
| Synaptophysin antibody | Abcam | ab18008-50 | |
| NeuN antibody | Chemicon | MAB377 | |
| Synapsin antibody | Novus | NB300-104 | |
| Anti mouse FITC | Jackson Immuno | 115-095-146 | |
| Research Laboratories | |||
| Anti Rabbit Cy3 | Jackson Immuno | 711-165-152 | |
| Research Laboratories | |||
| BSA | Sigma | A1653 | |
| Triton-X 100 | Acros | 21568-2500 | |
| Paraformaldehye | Fisher | 4042 | |
| Coverslip (Big circle cover slip) | Fisherbrand | 12-545-102 | |
| Mounting medium (Prolong Gold) | Invitrogen | P36930 | |
| Pen membrane | Applied biosystems | LCM0521 | |
| Histogene LCM frozen section staining kit | Applied biosystems | KIT0401 | |
| RiboAmp RNA Amplification kit | Applied biosystems | KIT0201 | |
| Picopure RNA Isolation kit | Applied biosystems | KIT0202 | |
| CapsureMacro LCM caps | Applied biosystems | LCM0211 |
References
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