Trypsin Digest protokol Analyser Retinal kar en musemodel

Summary

Trypsin fordøjelse er en af ​​de mest almindeligt anvendte metoder til at analysere retinal vaskulatur. Dette håndskrift beskrives metoden i detaljer, herunder centrale ændringer for at optimere teknikken og fjerne ikke-vaskulære væv og samtidig bevare den overordnede arkitektur af skibene.

Abstract

Trypsin digest er guld standard metode til at analysere den retinale kar ^1-5. Den tillader visualisering af hele netværket af komplekse tredimensionale retinale blodkar og kapillærer ved at skabe en todimensional flade-mount sammenkoblede vaskulære kanaler efter fordøjelse af ikke-vaskulære komponenter af nethinden. Dette gør det muligt at undersøge forskellige patologiske vaskulære ændringer, såsom mikroaneurismer, kapillær degeneration og abnorm endotel til pericyt forhold. Men den metode er teknisk udfordrende, især i mus, som er blevet den mest udbredte dyremodel til at studere nethinden på grund af den lette genetiske manipulationer ^6,7. Hos mus øje, er det særligt vanskeligt helt at fjerne ikke-vaskulære komponenter, samtidig med at den samlede opbygning af retinale blodkar. Til dato er der en mangel på litteratur, der beskriver trypsin digest teknikken i detaljer in musen. Dette håndskrift giver en detaljeret trin-for-trin metode af trypsin digest i muse nethinden, og samtidig give tips om fejlfinding vanskelige skridt.

Introduction

Visualisere vaskulaturen af ​​nethinden er en ekstremt vigtig at dissekere de mekanismer af forskellige øjensygdomme, såsom diabetisk retinopati. Det tillader en at vurdere de tidligste vaskulære abnormiteter, herunder mikroaneurismer, kapillær degeneration og pericyt tab ^8,9. Til dato har der været flere teknikker udviklet til at analysere den retinale vaskulatur. Perfusion af forskellige farvestoffer er blevet brugt til at fremhæve de skibe, men alle har delt lignende begrænsninger. Injektion sjældent fremhæver hele retinal vaskulatur medmindre gives på et højt pres, hvilket risikerer brud og beskadige fartøjer ^1.. Immunofarvning af vaskulær endotel med fluoroforen-mærket G isolectin B4 (Alexa Fluor 594 konjugeret, I21413, Invitrogen, 1:100 fortynding) og nethinde flade mounts kan fremhæve den overordnede arkitektur af skibene, men uden nærmere visualisering af kapillærer, kælderen membraner og pericytter . Det blev bemærket afFriedenwald at fartøjer kan fremhæves ved farvning flat-mounts af nethinden med periodisk syre-Schiff (PAS), eller hematoxylin og eosin (H & E) farvning ^10.. Men farvning var ikke-specifik for skibene og fremhævede den ikke-vaskulære væv samt, hvilket gør det vanskeligt at skelne skibene. I 1960'erne udviklede Cogan og Kuwabara trypsin fordøje teknik, der gjorde det nemmere at visualisere den retinale kar ved at fordøje nonvascular komponenter af nethinden ^1.. Siden dengang er trypsin fordøje blevet den gyldne standard metode til at analysere kar i nethinden ^2-5. Men det er vigtigt at bemærke, at andre alternative teknikker til at isolere vaskulaturen er blevet beskrevet. Anvendelsen af osmotiske lysis er blevet anvendt til at isolere vaskulaturen og tillade biokemiske undersøgelser af væv ^11,12, men proceduren er ikke blevet anvendt som en primær metode til anatomisk undersøgelse. Vævet print-metoden har væretanvendt til at isolere store segmenter af mikrovaskulaturen og giver mulighed for at studere electrotonic arkitektur karrene ^13.. I teorien kunne denne teknik også anvendes til at studere anatomiske ændringer, da kvaliteten af ​​de fartøjer, er høj. Men det er kun i stand til at isolere segmenter af hele vaskulatur netværket. Selv om disse metoder ikke kan erstatte trypsin fordøjelse, er det vigtigt at bemærke, at de har forskellige fordele og ulemper og er komplementære i denne henseende.

Trypsin Digest metode er teknisk udfordrende og er vanskelig at udføre konsekvent ^6,7. Desuden er det blevet bemærket, at trypsin fordøjelse er særlig svært på en musemodel, især hvis man ønsker at bevare den samlede vaskulære arkitektur af nethinden ^6,7. Udfordringer omfatter (1) over-fordøjelse af nethinden, der forårsager tab af både kar såvel som ikke-vaskulært væv, (2) under-fordøjelse, kræveromfattende mekanisk dissektion, som kunne føre til en beskadigelse af fartøjet seng, (3) dårlig adskillelse af den ikke-vaskulære væv fra vaskulaturen fører til ikke-specifik farvning. Adskillige håndskrifter har fremhævet disse udfordringer, men ingen har givet et detaljeret og konsekvent protokol at overvinde dem ^14,15. Dette håndskrift vil indføre en trin-for-trin metode beskriver teknikken til at udføre trypsin fordøje på mus og rotter nethinder med specifikke tips om håndtering af de særligt vanskelige skridt. En skematisk oversigt er vist i figur 1..

Protocol

1.. Retinal Forberedelse Enucleate musen øjet. Brug den ene hånd, åbne øjenlåg, så øjet er synligt. Med den anden hånd, ved hjælp af en buet pincet (buede opad) lægge pres på overlegne og ringere aspekter af kredsløb, før globussen stikker. Luk forsigtigt pincet på den bageste del af øjet og løfte i en kontinuerlig bevægelse for at enucleate øjet. Lave øje med 10% neutral bufret formalin i mindst 24 timer. Sted øje i PBS-opløsning i en lille petriskål. Disse…

Representative Results

Det endelige produkt af en vellykket procedure er en flad-mount af hele nettet af muse nethinden vaskulatur med arkitekturen bevares, farvet med enten PAS / hematoxylin eller H & E, som vist i figurerne 2-4. Klar differentiering af endotelceller og pericytter kan ses som vist i figur 3. I nethinden, er kernerne af endotelceller ovale eller aflange og ligge helt inden for karvæggen. Pericyt kerner er små, sfæriske, bejdse tæt og har generelt en udstående position langs kapillær…

Discussion

Trypsin fordøjelse er en standardmetode til vurdering vaskulaturen af ​​nethinden. Desværre er det teknisk udfordrende og kan resultere i høj prøve tab, hvis ikke udført korrekt. Desuden procedure er særlig vanskelig i mus, hvilket kan begrænse anvendelsen af ​​denne teknik i de almindeligt anvendte genetiske dyremodeller for øjensygdomme. Dette papir giver vejledning om, hvordan du udfører proceduren effektivt og konsekvent i mus øjne.

Der er flere kritiske trin i protokol…

Materials

			REAGENTS
10% neutral buffered formalin	Fischer Scientific	SF100-4
Trypsin (1:250)	Amresco	0458-50G	Make 3% trypsin in 0.1 M Tris
TRIZMA base	Sigma	T1503-1KG	Create 0.1 M Tris Buffer (pH 7.8 @ 37 °C)
TRIZMA	Sigma	T3253-500G
Steritop sterile vacuum bottle	Millipore	SCGPS05RE	Create filtered water
			EQUIPMENT
Dissecting microscope			Any microscope that allows good visualization of the retina is adequate. (10x is sufficient with working distance of 24 mm)
Straight scissors	Fine Science Tools	15024-10	Cutting edge: 8 mm; Tip diameter: 0.2 mm; 10 cm
Straight Forceps (Inox)	Dumont #5	11252-20	Biologie tip; 0.05 x 0.02 mm; 11 cm
Curved Forcepts (Dumostar)	Dumont #7	11297-10	Biologie tip; 0.07 x 0.04 mm; 11.5 cm
Dubnoff Metabolic Shaker Incubator	Precision Scientific	BDG59442	Shaker optional
24-well dish	Falcon	353047
Microscope Slides	VWR	82027-132