Trypsine protocole Digest pour analyser la vascularisation rétinienne d'un modèle de souris
Summary
Trypsine digest est l'une des méthodes les plus couramment utilisées pour analyser la vascularisation rétinienne. Ce manuscrit décrit la méthode en détail, y compris les modifications clés pour optimiser la technique et retirer le tissu non vasculaire tout en préservant l'architecture d'ensemble des navires.
Abstract
Trypsine digest est la méthode de référence pour analyser la vascularisation rétinienne 1-5. Il permet de visualiser l'ensemble du réseau de vaisseaux complexes tridimensionnels sanguins et des capillaires rétiniens en créant une plate-montage en deux dimensions des canaux vasculaires interconnectés après digestion des composants non-vasculaires de la rétine. Cela permet d'étudier diverses modifications pathologiques vasculaires, tels que les micro-anévrismes, la dégénérescence capillaire et anormal endothéliales des ratios pericyte. Cependant, la méthode est techniquement difficile, surtout chez la souris, qui sont devenus le modèle animal le plus largement disponible pour étudier la rétine en raison de la facilité de manipulations génétiques 6,7. Dans l'oeil de la souris, il est particulièrement difficile de supprimer complètement les composants non-vasculaires tout en conservant l'architecture globale des vaisseaux sanguins de la rétine. À ce jour, il ya une pénurie de littérature qui décrit la technique de digérer la trypsine en détail in la souris. Ce manuscrit fournit une méthodologie détaillée de la trypsine digest dans la rétine de souris, étape par étape, tout en fournissant des conseils sur les étapes de dépannage difficiles.
Introduction
Visualiser la vascularisation de la rétine est une approche extrêmement important de disséquer les mécanismes de diverses maladies oculaires comme la rétinopathie diabétique. Il permet d'évaluer les anomalies vasculaires premières, y compris les micro-anévrismes, la dégénérescence et la perte capillaire pericyte 8,9. À ce jour, il ya eu plusieurs techniques mises au point pour analyser la vascularisation rétinienne. Perfusion de divers colorants a été utilisé pour mettre en évidence les vaisseaux, mais tous ont partagé les mêmes limites. Injection met rarement toute la vascularisation rétinienne moins donné à une haute pression, ce qui risque de rupture et d'endommager les navires 1. Immunocoloration de l'endothélium vasculaire avec fluorophore marqué G isolectine B4 (Alexa Fluor 594 conjugué; I21413; Invitrogen; dilution 1:100) et les supports plats rétine peut mettre en évidence l'architecture globale des vaisseaux, mais sans visualisation détaillée des capillaires, les membranes basales et pericytes . Il a été noté parFriedenwald que les navires peuvent être mis en évidence par coloration plate-monts de rétine avec de l'acide périodique Schiff (PAS) ou hématoxyline et l'éosine (H & E) coloration 10. Cependant, la coloration était non spécifique aux vaisseaux et a souligné le tissu non vasculaire ainsi, il est difficile de différencier les vaisseaux. Dans les années 1960, Cogan et Kuwabara développé la technique la trypsine digest qui a rendu plus facile de visualiser la vascularisation rétinienne en digérant les composantes non vasculaires de la rétine 1. Depuis ce temps, la trypsine digest est devenue la méthode de référence dans l'analyse de la vascularisation de la rétine 2-5. Cependant, il est important de noter que d'autres alternatives techniques pour isoler le système vasculaire ont été décrits. L'utilisation de lyse osmotique a été utilisée pour isoler le système vasculaire et permettre des études biochimiques du tissu 11,12, mais la procédure n'a pas été utilisé comme méthode principale pour l'étude anatomique. Procédé d'impression de tissu estutilisée pour isoler de larges segments de microvascularisation et permet la possibilité d'étudier l'architecture électrotonique de la vascularisation 13. En théorie, cette technique pourrait également être utilisée pour étudier les changements anatomiques, comme la qualité des vaisseaux est élevé. Cependant, il est seulement capable d'isoler les segments de l'ensemble du réseau vasculaire. Bien que ces méthodes ne peuvent pas remplacer la trypsine digérer, il est important de noter qu'ils ont des avantages et des inconvénients et sont complémentaires à cet égard.
La méthode digest trypsine est techniquement difficile et il est difficile de performer de façon constante 6,7. En outre, il a été noté que la trypsine digest est particulièrement difficile sur un modèle de souris, en particulier si l'on veut préserver l'architecture vasculaire global de la rétine 6,7. Les défis incluent (1) sur-digestion de la rétine qui entraîne une perte à la fois du système vasculaire ainsi que le tissu non vasculaire, (2) sous-digestion, exigeantdissection étendue mécanique qui pourrait à son tour conduire à des lésions de la chambre de cuve (3), une mauvaise séparation des tissus non vasculaires du système vasculaire qui conduit à une coloration non spécifique. Plusieurs manuscrits ont mis en évidence ces défis, mais aucune n'a fourni un protocole détaillé et cohérent pour les surmonter 14,15. Ce manuscrit va introduire une méthodologie étape par étape décrivant la technique pour effectuer la trypsine digest sur la souris et le rat rétines avec des conseils spécifiques sur la manipulation des étapes particulièrement difficiles. Un aperçu schématique est illustré à la figure 1.
Protocol
Representative Results
Discussion
Trypsine digest est une méthode standard pour évaluer la vascularisation de la rétine. Malheureusement, il est techniquement difficile et peut entraîner des taux de perte de spécimen s'il n'est pas effectué correctement. En outre, la procédure est particulièrement difficile chez la souris, ce qui peut limiter l'application de cette technique dans les modèles animaux génétiques couramment utilisés de maladies oculaires. Ce document fournit des conseils sur la façon d'exécuter de manière eff…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été partiellement financé par le NIH RO1-EY019951 (AAF), Illinois Société pour la Prévention de la Cécité (JCC, AAF), les fonds non affectés au Département d'ophtalmologie de la recherche pour prévenir la cécité (RPB), New York et RPB étudiant en médecine Fellowship Grant (JCC).
Materials
| REAGENTS | |||
| 10% neutral buffered formalin | Fischer Scientific | SF100-4 | |
| Trypsin (1:250) | Amresco | 0458-50G | Make 3% trypsin in 0.1 M Tris |
| TRIZMA base | Sigma | T1503-1KG | Create 0.1 M Tris Buffer (pH 7.8 @ 37 °C) |
| TRIZMA | Sigma | T3253-500G | |
| Steritop sterile vacuum bottle | Millipore | SCGPS05RE | Create filtered water |
| EQUIPMENT | |||
| Dissecting microscope | Any microscope that allows good visualization of the retina is adequate. (10x is sufficient with working distance of 24 mm) | ||
| Straight scissors | Fine Science Tools | 15024-10 | Cutting edge: 8 mm; Tip diameter: 0.2 mm; 10 cm |
| Straight Forceps (Inox) | Dumont #5 | 11252-20 | Biologie tip; 0.05 x 0.02 mm; 11 cm |
| Curved Forcepts (Dumostar) | Dumont #7 | 11297-10 | Biologie tip; 0.07 x 0.04 mm; 11.5 cm |
| Dubnoff Metabolic Shaker Incubator | Precision Scientific | BDG59442 | Shaker optional |
| 24-well dish | Falcon | 353047 | |
| Microscope Slides | VWR | 82027-132 |
References
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