Trypsin fordøye er en av de mest brukte metodene for å analysere retinal blodkar. Dette manuskriptet beskriver metoden i detalj, inkludert viktige endringer for å optimalisere teknikken og fjerne ikke-vaskulære vev samtidig bevare den generelle arkitekturen av skipene.
Trypsin fordøye er gullstandarden metode for å analysere retinal blodkar 1-5. Den tillater visualisering av hele nettverket av komplekse tredimensjonale retinale blodkar og kapillærer ved å skape en todimensjonal flate-montering av de sammenkoblede vaskulære kanaler etter oppslutning av de ikke-vaskulære komponenter av netthinnen. Dette gjør det mulig å studere ulike patologiske vaskulære endringer, for eksempel microaneurysms, kapillær degenerasjon og unormal endotelceller til pericyte forholdstall. Imidlertid er fremgangsmåten teknisk krevende, særlig hos mus, som er blitt den mest tilgjengelige dyremodell for å studere retina på grunn av den enkle genetiske manipulasjoner 6,7. I mus øyet, er det spesielt vanskelig å fjerne ikke-vaskulære komponenter og samtidig opprettholde den generelle arkitekturen av de retinale blodkar. Til dags dato, er det en mangel på litteratur som beskriver trypsin fordøye teknikken i detalj in musen. Dette manuskriptet gir en detaljert steg-for-trinn metode for trypsin fordøye i mus netthinnen, samtidig gir tips om feilsøking vanskelige trinn.
Visualisere blodkar i netthinnen er en ekstremt viktig tilnærming for å dissekere mekanismene for ulike øyesykdommer som diabetisk retinopati. Det gjør det mulig å vurdere de tidligste karlidelser, inkludert microaneurysms, kapillær degenerasjon, og pericyte tap 8,9. Hittil har det vært flere teknikker utviklet for å analysere retinal blodkar. Perfusjon av ulike fargestoffer har blitt brukt til å markere skipene, men alle har delt samme begrensninger. Injeksjon fremhever sjelden hele retinal blodkar mindre gitt på et høyt trykk, som risikerer sprekker og skader på skipene en. Farging av blodåreendotelets med fluorophore-merket G isolectin B4 (Alexa Fluor 594 konjugert; I21413, Invitrogen, 1:100 fortynning) og netthinnens flate mounts kan markere den generelle arkitekturen av skipene, men uten detaljert visualisering av kapillærene, kjelleren membraner og pericytes . Det ble bemerket avFriedenwald at fartøy kan bli markert ved farging flat-beslag av netthinnen med periodiske syre-Schiff (PAS) eller hematoxylin og eosin (H & E) farging 10. Imidlertid var flekker uspesifikk til skipene og fremhevet den ikke-vaskulære vev i tillegg, noe som gjør det vanskelig å skille skipene. I 1960, utviklet Cogan og Kuwabara trypsin fordøye teknikk som gjorde det lettere å visualisere retinal blodkar ved å fordøye de nonvascular komponentene i netthinnen en. Siden den gang har trypsin fordøye blitt gullstandarden metode i å analysere blodkar i netthinnen 2-5. Det er imidlertid viktig å merke seg at andre alternative teknikker for å isolere blodkar er blitt beskrevet. Bruken av osmotisk lysering har blitt brukt for å isolere blodkar og tillate biokjemiske studier av vevet 11,12, men fremgangsmåten er ikke benyttet som en primær fremgangsmåte for anatomisk undersøkelse. Vevet print metoden har værtanvendt for isolering av store segmenter av mikrosirkulasjon og tillater evnen til å studere den electrotonic arkitekturen av vaskulaturen 13.. I teorien kunne denne teknikk også anvendes til å studere anatomiske forandringer, som kvaliteten av fartøyene er høy. Det er imidlertid bare i stand til å isolere deler av blodkar hele nettverket. Selv om disse metodene ikke kan erstatte trypsin fordøye, er det viktig å merke seg at de har forskjellige fordeler og svakheter, og er komplementære i denne forbindelse.
Det trypsin-digest metoden er teknisk krevende og er vanskelig å utføre gjennomgående 6,7. Videre har det blitt bemerket at trypsin digest er spesielt vanskelig på en musemodell, særlig hvis man ønsker å bevare den totale vaskulær arkitekturen av netthinnen 6,7. Utfordringene omfatter (1) over-fordøyelse av retina som forårsaker tap av både blodkar samt ikke-vaskulært vev, (2) under-fordøyelse, som kreveromfattende mekanisk disseksjon som igjen kan føre til skader på fartøyet sjikt, (3) dårlig separering av den ikke-vaskulære vev fra det vaskulære karet som fører til ikke-spesifikk farging. Flere manuskripter har fremhevet disse utfordringene, men ingen har gitt en detaljert og konsistent protokollen for å overvinne dem 14,15. Dette manuskriptet vil innføre en trinn-for-trinn metode detaljering teknikk for å utføre trypsin fordøye på mus og rotter netthinne med konkrete tips om håndtering av spesielt vanskelige trinn. En skjematisk oversikt er vist i figur 1..
Trypsin digest er en standard metode for å vurdere vaskulatur av netthinnen. Dessverre er det teknisk utfordrende og kan resultere i høye frekvensen av prøven tap dersom ikke riktig utført. Videre er fremgangsmåten spesielt vanskelig i mus, noe som kan begrense anvendelsen av denne teknikk i vanlig brukte genetiske dyremodeller av øyesykdommer. Denne artikkelen gir veiledning om hvordan du skal utføre prosedyren effektivt og konsekvent i mus øyne.
Det er flere viktige skritt i protok…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble delvis støttet av NIH RO1-EY019951 (AAF), Illinois Society for Prevention of Blindness (JCC, AAF), frie midler til Institutt for Ophthalmology fra forskning for å forhindre blindhet (RPB), NY og RPB Medical Student Fellowship Grant (JCC).
REAGENTS | |||
10% neutral buffered formalin | Fischer Scientific | SF100-4 | |
Trypsin (1:250) | Amresco | 0458-50G | Make 3% trypsin in 0.1 M Tris |
TRIZMA base | Sigma | T1503-1KG | Create 0.1 M Tris Buffer (pH 7.8 @ 37 °C) |
TRIZMA | Sigma | T3253-500G | |
Steritop sterile vacuum bottle | Millipore | SCGPS05RE | Create filtered water |
EQUIPMENT | |||
Dissecting microscope | Any microscope that allows good visualization of the retina is adequate. (10x is sufficient with working distance of 24 mm) | ||
Straight scissors | Fine Science Tools | 15024-10 | Cutting edge: 8 mm; Tip diameter: 0.2 mm; 10 cm |
Straight Forceps (Inox) | Dumont #5 | 11252-20 | Biologie tip; 0.05 x 0.02 mm; 11 cm |
Curved Forcepts (Dumostar) | Dumont #7 | 11297-10 | Biologie tip; 0.07 x 0.04 mm; 11.5 cm |
Dubnoff Metabolic Shaker Incubator | Precision Scientific | BDG59442 | Shaker optional |
24-well dish | Falcon | 353047 | |
Microscope Slides | VWR | 82027-132 |