Трипсин Digest протокола для анализа сосудистой сети сетчатки модели мыши
Summary
Трипсин дайджеста является одним из наиболее широко используемых методов анализа ретинальных сосудов. Эта рукопись описывает способ, в деталях, в том числе ключевых изменений для оптимизации техники и удалить не-сосудистой ткани, сохраняя при этом общую архитектуру сосудов.
Abstract
Трипсин дайджеста является золотым стандартом метод анализа сосудистой сети сетчатки 1-5. Это позволяет визуализировать всю сеть сложных трехмерных кровеносных сосудов сетчатки и капилляров путем создания двумерной плоской горы взаимосвязанных сосудистые каналы, после переваривания несосудистые компонентов сетчатки. Это позволяет изучать различные патологические изменения сосудов, таких как микроаневризмы, капиллярные дегенерации, и аномальные эндотелиальных к перицитами соотношениях. Тем не менее, этот метод является технически сложным, особенно у мышей, которые стали наиболее широко доступны животная модель для изучения сетчатки из-за легкости генетических манипуляций 6,7. У мышей глаз, это особенно трудно полностью удалить несосудистые компонентов при сохранении общей архитектуры кровеносных сосудов сетчатки. На сегодняшний день существует нехватка литературы, описывающий технику трипсина дайджест подробно яп мыши. Эта рукопись содержит подробный шаг за шагом методологии трипсина дайджеста в сетчатке мышей, а также предоставляет советы по устранению неисправностей трудных шагов.
Introduction
Визуализация сосудистой сети сетчатки является чрезвычайно важным подходом к рассекают механизмы различных заболеваний глаз, таких как диабетическая ретинопатия. Это позволяет оценить ранние сосудистые аномалии, в том числе микроаневризмы, капиллярные дегенерации и потери перицитами 8,9. На сегодняшний день было проведено несколько методов, разработанных для анализа сосудистой сети сетчатки. Перфузии различные красители были использованы для выделения сосудов, но все они сталкиваются с аналогичными ограничениями. Инъекции редко освещает всю сосудистую сеть сетчатки если не дано при высоком давлении, что риск разрушения и повреждения судов 1. Иммуноокрашивание сосудистого эндотелия с флуорофором меченных G isolectin B4 (Alexa Fluor 594 конъюгированные; I21413; Invitrogen; разведении 1:100) и сетчатки плоские крепления можно выделить общую архитектуру сосудов, но без детальной визуализацией капилляров, базальной мембраны и перицитах . Было отмечено,Friedenwald, что суда могут быть выделены путем окрашивания плоским крепления сетчатки с периодическими кислотно-Шиффа (PAS) или гематоксилином и эозином (H & E) окрашивание 10. Тем не менее, окрашивание неспецифической к сосудам и особо не-сосудистой ткани, а также, что делает его трудно отличить сосудов. В 1960 году Коган и Кувабара разработана методика трипсина дайджеста, который сделал его легче визуализировать сосудистую сеть сетчатки расщеплением несосудистой компонентов сетчатки 1. С того времени, трипсин дайджест стала золотым стандартом метод в анализе сосудистой сетчатки 2-5. Однако, важно отметить, что другие альтернативные методы, чтобы изолировать сосудистой были описаны. Использование осмотический лизис был использован, чтобы изолировать сосудистой и позволяют биохимических исследований тканей 11,12, но процедура не был использован в качестве основного метода для анатомического исследования. Метод печати ткань былаиспользована для выделения больших сегментов микрососудов и позволяет способности к обучению электротоническим архитектуры сосудистой 13. Теоретически, этот метод может быть также использован для изучения анатомических изменений, так как качество сосудов является высокой. Тем не менее, это только возможность изолировать сегменты всей сосудистой сети. Хотя эти методы не могут заменить трипсин дайджест, важно отметить, что они имеют различные преимущества и недостатки, и дополняют друг друга в этом отношении.
Метод трипсина дайджеста является технически сложным и трудно выполнить последовательно 6,7. Кроме того, было отмечено, что трипсин дайджест особенно трудно на мышиной модели, в частности, если он желает сохранить общую архитектуру сосудистой сетчатки 6,7. Проблемы включают в себя (1) по-пищеварению сетчатки, которая приводит к потере как сосудистую, а также не-сосудистую ткань, (2) при-пищеварения, требующихобширные механические рассечение который в свою очередь может привести к повреждению сосуда кровать, (3) плохое разделение не-сосудистую ткань из сосудистой приводит к неспецифическое окрашивание. Несколько рукописей выявили эти проблемы, но ни один не представил подробный и последовательный протокол их преодоления 14,15. Эта рукопись представит шаг за шагом методологии подробно технику для выполнения трипсина дайджест на мышей и крыс с сетчатки конкретные советы по обращению с особенно трудным шагом. Схематический обзор показано на рисунке 1.
Protocol
Representative Results
Discussion
Трипсин дайджеста является стандартным методом оценки сосудистой сетчатки. К сожалению, это технически сложно и может привести к высокой скорости потери образца при их неправильном выполнении. Кроме того, процедура особенно трудно у мышей, которые могут ограничить применение этого м?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была частично поддержана NIH RO1-EY019951 (AAF), Иллинойс общества по профилактике слепоты (СКК, AAF), свободные средства на кафедре офтальмологии от научных исследований до предотвратить слепоту (РПБ), Нью-Йорк и РПБ студент-медик стипендии, (СКК).
Materials
| REAGENTS | |||
| 10% neutral buffered formalin | Fischer Scientific | SF100-4 | |
| Trypsin (1:250) | Amresco | 0458-50G | Make 3% trypsin in 0.1 M Tris |
| TRIZMA base | Sigma | T1503-1KG | Create 0.1 M Tris Buffer (pH 7.8 @ 37 °C) |
| TRIZMA | Sigma | T3253-500G | |
| Steritop sterile vacuum bottle | Millipore | SCGPS05RE | Create filtered water |
| EQUIPMENT | |||
| Dissecting microscope | Any microscope that allows good visualization of the retina is adequate. (10x is sufficient with working distance of 24 mm) | ||
| Straight scissors | Fine Science Tools | 15024-10 | Cutting edge: 8 mm; Tip diameter: 0.2 mm; 10 cm |
| Straight Forceps (Inox) | Dumont #5 | 11252-20 | Biologie tip; 0.05 x 0.02 mm; 11 cm |
| Curved Forcepts (Dumostar) | Dumont #7 | 11297-10 | Biologie tip; 0.07 x 0.04 mm; 11.5 cm |
| Dubnoff Metabolic Shaker Incubator | Precision Scientific | BDG59442 | Shaker optional |
| 24-well dish | Falcon | 353047 | |
| Microscope Slides | VWR | 82027-132 |
References
- Kuwabara, T., Cogan, D. G. Studies of retinal vascular patterns. I. Normal architecture. Arch. Ophthalmol. 64, 904-911 (1960).
- Kuwabara, T., Cogan, D. G. Retinal vascular patterns. VII. Acellular change. Invest. Ophthalmol. 4, 1049-1064 (1965).
- Bell, W. R., Green, W. R., Goldberg, M. F. Histopathologic and trypsin digestion studies of the retina in incontinentia pigmenti. Ophthalmology. 115, 893-897 (2008).
- Danis, R. P., Wallow, I. H. HRP/trypsin technique for studies of the retinal vasculature. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 27, 434-437 (1986).
- Kim, S. H., Chu, Y. K., Kwon, O. W., McCune, S. A., Davidorf, F. H. Morphologic studies of the retina in a new diabetic model; SHR/N:Mcc-cp rat. Yonsei Med. J. 39, 453-462 (1998).
- Cuthbertson, R. A., Mandel, T. E. Anatomy of the mouse retina. Endothelial cell-pericyte ratio and capillary distribution. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 27, 1659-1664 (1986).
- Laver, N. M., Robison, W. G., Pfeffer, B. A. Novel procedures for isolating intact retinal vascular beds from diabetic humans and animal models. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 34, 2097-2104 (1993).
- Midena, E., et al. Studies on the retina of the diabetic db/db mouse. I. Endothelial cell-pericyte ratio. Ophthalmic Res. 21, 106-111 (1989).
- . Chapter 30. Diabetic Retinopathy. , (2005).
- Rosenblatt, B., Benson, W. E., Yannoff, M., Duker, J. Chapter 6.19 Diabetic Retinopathy. Ophthalmology. , (2008).
- Friedenwald, J. S. A new approach to some problems of retinal vascular disease. Am. J. Ophthalmol. 32, 487-498 (1949).
- Podesta, F., et al. Bax is increased in the retina of diabetic subjects and is associated with pericyte apoptosis in vivo and in vitro. Am. J. Pathol. 156 (10), 1025-1032 (2000).
- Dagher, Z., et al. Studies of rat and human retinas predict a role for the polyol pathway in human diabetic retinopathy. Diabetes. 53, 2404-2411 (2004).
- Puro, D. G. Retinovascular physiology and pathophysiology: new experimental approach/new insights. Prog. Retin. Eye Res. 31, 258-270 (2012).
- Roy, S., Nasser, S., Yee, M., Graves, D. T., Roy, S. A long-term siRNA strategy regulates fibronectin overexpression and improves vascular lesions in retinas of diabetic rats. Mol. Vis. 17, 3166-3174 (2011).
- Li, Q., et al. Diabetic eNOS-knockout mice develop accelerated retinopathy. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 51, 5240-5246 (2010).
- Connor, K. M., et al. Quantification of oxygen-induced retinopathy in the mouse: a model of vessel loss, vessel regrowth and pathological angiogenesis. Nature Protocols. 4, 1565-1573 (2009).
