Caracterização de Respostas Inflamatórias Durante Colonização Intranasal com Streptococcus pneumoniae
Summary
A colonização da nasofaringe murina com Streptococcus pneumoniae e a subsequente extração de células aderentes ou recrutadas é descrita. Esta técnica envolve a lavagem da nasofaringe e a coleta do fluido através das nares e é adaptável para várias leituras, incluindo quantificação celular diferencial e análise da expressão mRNA in situ.
Abstract
A colonização nasofaríngea por Streptococcus pneumoniae é um pré-requisito para a invasão aos pulmões ou corrente sanguínea1. Este organismo é capaz de colonizar a superfície mucosa da nasofaringe, onde pode residir, multiplicar e eventualmente superar as defesas hospedeiras para invadir outros tecidos do hospedeiro. O estabelecimento de uma infecção no trato respiratório normalmente inferior resulta em pneumonia. Alternativamente, as bactérias podem se disseminar na corrente sanguínea causando bacteremia, que está associada a altas taxas de mortalidade2, ou então levar diretamente ao desenvolvimento de meningite pneumocócica. Entender a cinética e as respostas imunológicas à colonização nasofaríngea é um aspecto importante dos modelos de infecção por S. pneumoniae.
Nosso modelo de camundongos de colonização intranasal é adaptado dos modelos humanos3 e tem sido usado por vários grupos de pesquisa no estudo de respostas hospedeiras-patógenos na nasofaringe4-7. Na primeira parte do modelo, utilizamos um isolado clínico de S. pneumoniae para estabelecer uma colonização bacteriana auto-limitante que seja semelhante aos eventos de transporte em adultos humanos. O procedimento aqui detalhado envolve a preparação de um inóculo bacteriano, seguido da criação de um evento de colonização através da entrega do inóculo através de uma via intranasal de administração. Macrófagos residentes são o tipo de célula predominante na nasofaringe durante o estado estável. Normalmente, há poucos linfócitos presentes em camundongos não infectados8, no entanto a colonização mucosa levará a inflamações de baixo a alto grau (dependendo da virulência das espécies bacterianas e da cepa) que resultarão em uma resposta imune e o subsequente recrutamento de células imunes hospedeiras. Essas células podem ser isoladas por um lavado do conteúdo traqueal através das nares, e correlacionadas com a densidade das bactérias de colonização para entender melhor a cinética da infecção.
Protocol
Representative Results
Discussion
Neste estudo, foram apresentados métodos detalhados para a colonização intranasal de camundongos utilizando uma cepa de streptococcus pneumoniae e o subsequente isolamento e caracterização das células imunes recrutadas para nasofaringe em resposta à bactéria. Demonstramos como um inóculo bacteriano pode ser cultivado em mídia rica em nutrientes e usado para estabelecer um evento de colonização em camundongos, que é inicialmente restrito à nasofaringe. Em seguida, mostramos como os tipos de células…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores gostariam de agradecer ao Dr. Jeffery Weiser da Universidade da Pensilvânia por seu dom das cepas clínicas de Streptococcus pneumoniae. Este trabalho foi financiado pelos Institutos Canadenses de Pesquisa em Saúde. Cv foi financiado por uma bolsa M. G. DeGroote e uma bolsa da Sociedade Torácica Canadense. Este trabalho foi financiado pela Ontário Lung Association e institutos canadenses de pesquisa em saúde (CIHR). O trabalho no laboratório Bowdish é apoiado em parte por Michael G. DeGroote Centre for Infectious Disease Research e pelo McMaster Imunology Research Centre.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | |
| Anti-Mouse Ly6C FITC | BD Pharmingen | 553104 | |
| Anti-Mouse Ly6G PE | BD Pharmingen | ||
| Anti-Mouse CD45.1 eFluor 450 | eBioscience | 48-0453-82 | |
| Anti-Mouse F4/80 Antigen APC | eBioscience | 17-4801-82 | |
| Anti-Mouse CD11c PerCP-Cy5.5 | eBioscience | 45-0114-82 | |
| Anti-Mouse CD11b PE-Cy7 | eBioscience | 25-0112-82 | |
| Anti-Mouse CD3 Alexa Fluor 700 | eBioscience | 56-0032-82 | |
| Anti-Mouse CD4 eFluor 605NC | eBioscience | 93-0041-42 | |
| Intramedic Polyethylene Tubing – PE20 | Becton Dickinson | 427406 | |
| BD 1ml Syringe | Becton Dickinson | 309659 | |
| BD 26G3/8 Intradermal Bevel | Becton Dickinson | 305110 | |
| Buffer RLT Lysis Buffer | Qiagen | 79216 | |
| Difco Tryptic Soy Agar | Becton Dickinson | 236950 | |
| Defibrinated Sheep Blood | PML Microbiologicals | A0404 | |
| RNAqueous-Micro Kit | Ambion | AM1931 | |
| M-MuLV Reverse Transcriptase | New England Biolabs | M0253L | |
| GoTaq qPCR Master Mix | Promega | A6001 |
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